Wykrywanie bakterii z rodzaju Salmonella metodą Real-Time PCR obejmuje kolejne etapy analizy mikrobiologicznej i molekularnej. Na wiarygodność wyniku wpływają między innymi reprezentatywność próbki, wzbogacanie, właściwości matrycy, izolacja DNA oraz kontrole reakcji. Artykuł przedstawia również interpretację wyników, znaczenie walidacji oraz charakterystykę dwóch systemów analitycznych.
Przebieg badania Salmonella metodą Real-Time PCR
Wykrywanie Salmonella PCR jest procesem analitycznym, w którym klasyczna mikrobiologia łączy się z biologią molekularną. Nie można sprowadzić go wyłącznie do umieszczenia próbki w termocyklerze, ponieważ reakcja PCR stanowi dopiero końcową część całego postępowania. Wiarygodność wyniku zależy od sposobu pobrania próbki, jej homogenizacji, warunków wzbogacania, skuteczności izolacji DNA, obecności substancji hamujących reakcję oraz prawidłowego działania kontroli [1,2]. Pełny przebieg badania można wskazać jako:
(najczęściej od około 8 do 24 godzin)
(najczęściej około 60–90 minut)
Czas badania i reprezentatywność próbki
Najdłuższą częścią procedury nie jest sama reakcja PCR, lecz wzbogacanie mikrobiologiczne. Analiza molekularna, obejmująca lizę, przygotowanie reakcji i amplifikację, może zakończyć się w ciągu około dwóch godzin, natomiast oczekiwanie na wzrost bakterii trwa zazwyczaj od kilku do kilkunastu godzin. Biologia molekularna umożliwia szybkie i swoiste rozpoznanie docelowej sekwencji DNA. Dzięki temu Real-Time PCR Salmonella może znacząco skrócić czas uzyskania wyniku w porównaniu z pełną metodą hodowlaną, szczególnie w odniesieniu do próbek ujemnych. Hodowla potwierdza zdolność bakterii do wzrostu i pozwala uzyskać izolat przeznaczony do identyfikacji, serotypowania lub dalszych badań. PCR informuje o obecności docelowego DNA, ale sam nie pozwala jednoznacznie stwierdzić, czy wykryty materiał pochodzi wyłącznie z żywych komórek. Prawidłowe badanie Salmonella w żywności zaczyna się przed rozpoczęciem pracy laboratoryjnej. Największy błąd może powstać już podczas pobierania materiału. Rozmieszczenie bakterii w matrycy ma często charakter punktowy lub skupiskowy. Bakterie mogą znajdować się tylko na powierzchni produktu, w pojedynczej części opakowania, w grudce przyprawy, w określonej warstwie produktu albo w miejscu kontaktu z zanieczyszczonym urządzeniem. Ujemny wynik próbki o masie 25 g nie oznacza zatem bezwzględnej nieobecności Salmonella w całej partii produkcyjnej. Oznacza jedynie, że w przebadanej porcji, przy zastosowaniu konkretnej procedury i jej określonej granicy wykrywalności, nie wykryto bakterii lub ich DNA. Reprezentatywność zależy od planu pobierania, liczby próbek elementarnych, wielkości próbki zbiorczej, sposobu transportu oraz warunków przechowywania. Po dostarczeniu materiału do laboratorium próbkę łączy się z odpowiednią ilością podłoża i homogenizuje. Celem homogenizacji jest nie tylko rozdrobnienie produktu, lecz przede wszystkim możliwie równomierne przeniesienie bakterii do fazy płynnej. Rodzaj i wielkość próbki, jej pochodzenie, skład podłoża, temperatura inkubacji oraz czas namnażania wpływają na prawdopodobieństwo wykrycia Salmonella [4].
Znaczenie matrycy i wzbogacania
Szczególne trudności powodują produkty wysokotłuszczowe, przyprawy, kakao, czekolada, mleko w proszku, surowe mięso, warzywa bogate w polifenole oraz próbki środowiskowe zawierające pozostałości detergentów lub materiał biofilmowy. Metoda skuteczna dla mięsa mielonego nie musi działać równie dobrze w pieprzu, czekoladzie albo produkcie o niskiej aktywności wody. Z tego względu zakres walidacji metody musi odpowiadać rzeczywiście badanym matrycom. Wzbogacanie próbki PCR jest konieczne przede wszystkim ze względu na niski poziom kontaminacji. Bezpośrednie pobranie kilku mikrolitrów homogenatu może nie zawierać ani jednej komórki, nawet jeżeli w całej próbce analitycznej Salmonella jest obecna. Po kilku lub kilkunastu godzinach wzrostu liczba bakterii zwiększa się, dzięki czemu prawdopodobieństwo pobrania docelowego DNA do reakcji staje się znacznie większe.
Regeneracja komórek i skuteczność wykrywania
Wzbogacanie umożliwia również regenerację komórek uszkodzonych technologicznie. Początkowo stosuje się najczęściej podłoże nieselektywne, takie jak buforowana woda peptonowa, ponieważ zbyt silna selekcja mogłaby zahamować wzrost osłabionych komórek. Dopiero po odzyskaniu aktywności metabolicznej bakterie są zdolne do intensywnego namnażania. Etap ten ogranicza ponadto wpływ matrycy. Podczas inkubacji składniki produktu ulegają rozcieńczeniu w podłożu, a do ekstrakcji pobiera się tylko część płynnej hodowli. Nie usuwa to wszystkich inhibitorów, ale często zmniejsza ich stężenie w materiale kierowanym do PCR. Czas niezbędny do osiągnięcia wykrywalnego poziomu zależy od początkowej liczby komórek, ich kondycji, rodzaju żywności, składu mikroflory konkurencyjnej, temperatury i podłoża. Przy poziomie wynoszącym około 1–10 CFU w 25 g produktu wykrycie może następować później niż przy wyższym poziomie kontaminacji. Badania wykazały również, że samo zwiększenie objętości pobieranej do ekstrakcji z 1 do 10 ml nie zawsze poprawia skuteczność wykrywania. Większe znaczenie mogą mieć rozmieszczenie bakterii, dynamika ich wzrostu oraz efektywność oczyszczania DNA [3].
Czas wzbogacania i przygotowanie DNA
Zbyt krótkie wzbogacanie zwiększa ryzyko wyniku fałszywie ujemnego. Skrócenie inkubacji może być stosowane wyłącznie wtedy, gdy zostało przewidziane i sprawdzone w zwalidowanym protokole dla konkretnej matrycy, wielkości próbki i podłoża. W klasycznych procedurach PCR wzbogacanie trwa często od 18 do 24 godzin. W jednej z metod około dwudziestogodzinne przed namnażanie pozwalało na regenerację uszkodzonych komórek i uzyskanie wyniku PCR w czasie około 24 godzin, podczas gdy pełna metoda hodowlana wymagała czterech lub pięciu dni [2]. Po zakończeniu inkubacji z hodowli pobiera się alikwotę, z której uwalnia się DNA. Można zastosować prostą lizę termiczną, żywicę chelatującą, oczyszczanie kolumnowe, separację magnetyczną albo gotowy zestaw przeznaczony do danego systemu. Im prostsza procedura, tym krótszy czas przygotowania, ale jednocześnie większe ryzyko pozostawienia substancji hamujących reakcję [5].
Krzywa amplifikacji i fluorescencja
Prawidłowa krzywa amplifikacji (poniżej) ma kształt sigmoidalny. Początkowo sygnał znajduje się na poziomie tła. Następnie rozpoczyna się faza wykładnicza, w której ilość produktu szybko rośnie. Po niej występuje faza liniowa i plateau, kiedy wydajność reakcji spada wskutek zużycia odczynników. Oprogramowanie określa moment przekroczenia ustalonego progu fluorescencji i przypisuje reakcji wartość Ct lub Cq.
Fluorescencja
│ ───────── plateau
│ ____/
│ ____/ faza liniowa
│ ____/
próg │--------------X---------------------------
│ ____/ faza wykładnicza
│_________/ sygnał tła
└──────────────────────────────────────────
numer cyklu
↑
Cq
Kontrole jakości reakcji PCR
Późne, nieregularne albo bardzo płaskie krzywe mogą świadczyć o małej ilości DNA, częściowej inhibicji, błędzie pipetowania, nieswoistej amplifikacji lub problemie technicznym. W systemach komercyjnych ostateczna klasyfikacja nie powinna opierać się wyłącznie na ręcznym odczycie Ct, lecz na kryteriach określonych przez zwalidowany algorytm producenta. Wiarygodny wynik wymaga jednoczesnego zastosowania kontroli dodatniej, ujemnej, wewnętrznej i kontroli procesu. Kontrola dodatnia zawiera docelową sekwencję DNA i powinna dać prawidłowy sygnał amplifikacji. Potwierdza działanie odczynników, termocyklera, starterów, sondy i kanału fluorescencji. Jej brak może oznaczać awarię reakcji lub niewłaściwe warunki przebiegu testu.
Interpretacja wyników positive i negative
Kontrola ujemna nie zawiera DNA Salmonella i nie powinna wykazywać sygnału docelowego. Jej amplifikacja wskazuje na możliwość zanieczyszczenia odczynników, stanowiska pracy lub przeniesienia materiału między próbkami. Taka sytuacja zwykle wymaga powtórzenia serii i ustalenia źródła kontaminacji. Kontrola wewnętrzna, określana jako IAC lub IPC, jest amplifikowana równolegle w każdej próbce. Pozwala wykryć zahamowanie PCR, brak któregoś składnika, błąd dozowania lub awarię reakcji. Jeżeli próbka nie daje sygnału Salmonella, ale kontrola wewnętrzna przebiega prawidłowo, wynik ujemny może zostać uznany za ważny. Wynik positive oznacza, że wykryto amplifikację docelowej sekwencji spełniającą kryteria testu, a kontrole serii były prawidłowe. Poprawny opis wyniku powinien brzmieć: „w badanej wzbogaconej próbce wykryto docelową sekwencję DNA charakterystyczną dla Salmonella spp.”. Nie należy stwierdzać, że aparat bezpośrednio wykrył żywą bakterię. Wynik negative oznacza brak wykrywalnego sygnału docelowego przy prawidłowym działaniu kontroli wewnętrznej i pozostałych kontroli serii. Wynik odnosi się do badanej porcji próbki, zastosowanego protokołu i granicy wykrywalności. Nie stanowi absolutnego dowodu nieobecności Salmonella w całej partii.
Wynik invalid
Wynik invalid oznacza, że nie można wiarygodnie zaklasyfikować próbki. Najczęstszą przyczyną jest brak sygnału celu i jednoczesny brak prawidłowej amplifikacji kontroli wewnętrznej. Może to wynikać z obecności inhibitorów, zbyt dużej ilości materiału, tłuszczu lub osadu w lizacie, błędu pipetowania albo awarii aparatu. Postępowanie może obejmować rozcieńczenie lizatu, ponowną ekstrakcję, ponowne pobranie alikwoty ze wzbogacenia albo powtórzenie całej procedury.
Znaczenie wartości Ct lub Cq
Ct lub Cq oznacza numer cyklu, w którym fluorescencja przekracza określony próg. Niższa wartość zwykle wskazuje na większą ilość docelowego DNA w reakcji, a wyższa na mniejszą jego ilość lub częściową inhibicję. W jakościowym PCR w mikrobiologii żywności nie należy jednak bezpośrednio przeliczać Ct na liczbę CFU w pierwotnej próbce. Po wzbogacaniu wartość ta zależy od czasu inkubacji, tempa wzrostu szczepu, rodzaju produktu, obecności konkurencyjnej mikroflory, wydajności ekstrakcji oraz poziomu inhibicji. Próbka zawierająca początkowo mniej komórek może po intensywnym wzroście wykazać niższy Ct niż próbka o wyższym początkowym skażeniu, w której namnażanie zostało zahamowane.
ISO 6579-1 i walidacja metod alternatywnych
ISO 6579-1 opisuje referencyjną metodę wykrywania Salmonella w łańcuchu żywnościowym. Obejmuje ona przednamnażanie w podłożu nieselektywnym, namnażanie selektywne, posiew na podłoża wybiórczo-różnicujące, wybór podejrzanych kolonii oraz ich potwierdzenie biochemiczne i serologiczne. Procedura pozwala uzyskać żywy izolat, ale pełne badanie może trwać kilka dni. Metoda oparta na ISO 6579-1:2017/Amd 1:2020 wraz z potwierdzeniem może wymagać około pięciu dni [3]. Test Real-Time PCR jest metodą alternatywną, ponieważ jego zasada działania różni się od hodowli. Nie oznacza to, że metoda jest mniej wiarygodna, lecz że jej skuteczność musi zostać porównana z metodą referencyjną. ISO 16140-2 określa zasady walidacji komercyjnych metod alternatywnych względem metody referencyjnej. Walidacja obejmuje porównanie wyników w różnych kategoriach żywności, ocenę względnej granicy wykrywalności, inkluzywności i ekskluzywności oraz badanie międzylaboratoryjne [6]. Zakres certyfikatu określa matryce, wielkości próbek, podłoża, temperatury i czasy inkubacji, sposób lizy, wersję testu, aparat oraz oprogramowanie. Nie można automatycznie rozszerzać walidacji z próbki 25 g na 375 g ani z mięsa na przyprawy. Zmiana porcji lub rodzaju produktu wpływa na rozcieńczenie, stężenie inhibitorów, warunki wzrostu oraz prawdopodobieństwo równomiernego rozmieszczenia bakterii.
Potwierdzenie hodowlane i porównanie metod
Wynik dodatni metody molekularnej może wymagać potwierdzenia hodowlanego. Jest ono szczególnie istotne w badaniach urzędowych, przy wynikach niezgodnych, podczas dochodzeń epidemiologicznych oraz wtedy, gdy konieczne jest uzyskanie izolatu do serotypowania lub sekwencjonowania. Potwierdzenie powinno być przeprowadzone zgodnie z instrukcją zwalidowanej metody i odpowiednimi wymaganiami prawnymi.
| Kryterium | Metoda hodowlana, np. ISO 6579-1 | Real-Time PCR |
|---|---|---|
| Cel badania | Wykrycie i izolacja żywych komórek Salmonella. | Wykrycie określonej sekwencji DNA. |
| Mierzony sygnał | Wzrost kolonii i ich cechy fenotypowe. | Przyrost fluorescencji związany z amplifikacją. |
| Czas badania | Najczęściej kilka dni. | Zwykle około 10–24 godzin łącznie ze wzbogacaniem. |
| Czas właściwej detekcji | Kolejne inkubacje trwające wiele godzin. | Najczęściej około 60–90 minut. |
| Wzbogacanie | Przednamnażanie i namnażanie selektywne. | Zwykle przednamnażanie poprzedzające PCR. |
| Potwierdzenie | Stanowi część metody. | Może wymagać dalszego potwierdzenia hodowlanego. |
| Informacja o żywotności | Tak, ponieważ wymaga wzrostu bakterii. | Ograniczona, ponieważ wykrywane jest DNA. |
| Uzyskanie izolatu | Możliwe. | Niemożliwe bez równoległej hodowli. |
| Wpływ matrycy | Może hamować wzrost lub utrudniać izolację. | Może dodatkowo hamować ekstrakcję i amplifikację. |
| Zakres | Określony przez normę referencyjną. | Określony w certyfikacie walidacji. |
| Główna zaleta | Uzyskanie żywego izolatu i pełne potwierdzenie. | Szybki wynik przesiewowy i duża przepustowość. |
| Główne ograniczenie | Czasochłonność i pracochłonność. | Inhibicja, brak izolatu i wykrywanie samego DNA. |
Systemy BAX Q7 i QuantStudio 5 Food Safety
Zestawy diagnostyczne oparte na reakcji PCR są szeroko stosowane w analizie mikrobiologicznej żywności, w tym w wykrywaniu patogenów bakteryjnych. Systemy Hygiena BAX Q7 oraz QuantStudio 5 z testem SureTect Salmonella wykorzystują tę samą ogólną zasadę analityczną. Próbka jest najpierw wzbogacana, następnie komórki są lizowane, a otrzymany materiał poddaje się reakcji Real-Time PCR. Oba systemy pracują w formacie umożliwiającym jednoczesną analizę wielu próbek i wykorzystują oprogramowanie do automatycznej interpretacji wyników. BAX Q7 jest systemem o silnie zintegrowanym workflow. Aparat, testy, materiały eksploatacyjne i algorytm analizy stanowią jeden ekosystem. Po zakończeniu wzbogacania wykonuje się lizę zgodnie z instrukcją testu, przenosi materiał do gotowej reakcji i uruchamia program. Wynik jest przedstawiany w postaci obecności, nieobecności albo komunikatu błędu. Zaletą takiego rozwiązania jest standaryzacja oraz ograniczenie liczby decyzji podejmowanych przez operatora. QuantStudio 5 Food Safety z testem SureTect Salmonella również wykorzystuje gotowe odczynniki i automatyczną analizę. System może obsługiwać różne testy mikrobiologiczne, a oprogramowanie RapidFinder analizuje dane i klasyfikuje próbki jako dodatnie, ujemne lub nieważne. Workflow obejmuje wzbogacanie, lizę z użyciem odpowiednich odczynników, przeniesienie lizatu do mieszaniny PCR i analizę w aparacie. W obu systemach sam etap PCR trwa około jednej do półtorej godziny, dlatego głównym czynnikiem wpływającym na czas uzyskania wyniku pozostaje wzbogacanie. Różnica kilkunastu lub kilkudziesięciu minut między aparatami jest zazwyczaj mniej istotna niż możliwość zastosowania krótszego, zwalidowanego wzbogacania dla określonej matrycy.
Koszt całkowity i znaczenie kontroli procesu
Należy również ocenić całkowity koszt, uwzględniając nie tylko cenę jednego testu, ale również aparat, serwis, kalibracje, podłoża, materiały do lizy, końcówki, kontrole, powtórzenia wyników nieważnych, potwierdzenia hodowlane i czas pracy personelu. W praktyce największą korzyścią ekonomiczną może być szybkie uzyskanie wiarygodnego wyniku ujemnego i wcześniejsze zwolnienie partii produktu. Prawidłowe wykrywanie Salmonella PCR wymaga zatem kontroli całego procesu, a nie tylko etapu amplifikacji. Reprezentatywność próbki, skuteczne wzbogacanie próbki PCR, ograniczenie wpływu matrycy, usunięcie inhibitorów, zastosowanie kontroli i praca w zakresie walidacji są równie ważne jak parametry termocyklera. Dopiero połączenie tych elementów sprawia, że Real-Time PCR Salmonella może być wiarygodnym narzędziem stosowanym w rutynowym badaniu Salmonella w żywności.
Systemy Real-Time PCR opisane w artykule
BAX® Q7
System firmy Hygiena z oprogramowaniem do automatycznej interpretacji wyników.
Zobacz produkt na stronie Argenty
QuantStudio™ 5QuantStudio™ 5
System firmy Thermo Fisher Scientific wykorzystywany w artykule w połączeniu z testem SureTect Salmonella.
Zobacz produkt na stronie ArgentyNajważniejsze informacje
- Wiarygodność wyniku zależy od całego procesu analitycznego, a nie wyłącznie od etapu amplifikacji.
- Zakres walidacji musi odpowiadać badanym matrycom i wielkości próbek.
- Wynik Real-Time PCR dotyczy wykrywania DNA, a nie bezpośredniego potwierdzenia żywotności bakterii.
- Ocena Ct i klasyfikacja wyników wymagają stosowania kryteriów zwalidowanej metody.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ)
01Dlaczego etap wzbogacania jest istotny w wykrywaniu Salmonella metodą Real-Time PCR?
Wzbogacanie zwiększa liczbę bakterii obecnych w próbce, umożliwia regenerację komórek uszkodzonych technologicznie i może ograniczać wpływ składników matrycy na późniejszą analizę.
02Czy wynik ujemny PCR potwierdza nieobecność Salmonella w całej partii?
Nie. Wynik ujemny odnosi się do przebadanej porcji, zastosowanej procedury i jej granicy wykrywalności.
03Co oznacza wynik invalid w badaniu Real-Time PCR?
Wynik invalid oznacza, że nie można wiarygodnie zaklasyfikować próbki; przyczyną może być między innymi inhibicja reakcji lub brak prawidłowej amplifikacji kontroli wewnętrznej.
04Czy wartość Ct można bezpośrednio przeliczyć na CFU w próbce pierwotnej?
Nie. Po wzbogacaniu wartość Ct zależy między innymi od czasu inkubacji, wzrostu bakterii, matrycy, wydajności ekstrakcji i inhibicji.
05Czym różni się metoda hodowlana od Real-Time PCR w wykrywaniu Salmonella?
Metoda hodowlana umożliwia uzyskanie żywego izolatu, natomiast Real-Time PCR wykrywa określoną sekwencję DNA. Wynik dodatni PCR może wymagać potwierdzenia hodowlanego.
06Jakie systemy Real-Time PCR opisano w artykule?
Opisano systemy BAX Q7 oraz QuantStudio 5 Food Safety z testem SureTect Salmonella.
Źródło:
[1] Cheng C.-M. i wsp., nterlaboratory Validation for a Real-Time PCR Salmonella Detection Method Using the ABI 7500 FAST Real-Time PCR System, Journal of Food Protection, Vol. 78, No. 6, 2015, Pages 1119–1124 doi:10.4315/0362-028X.JFP-14-244
[2] Malorny B. i wsp., Diagnostic Real-Time PCR for Detection of Salmonella in Food. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec. 2004, p. 7046–7052 Vol. 70, No. 12 0099-2240/04/$08.0000 DOI: 10.1128/AEM.70.12.7046–7052.2004
[3] Cristiano D, Peruzy MF, Castellano S, et al. Toward same-day detection of Salmonella: a rapid and cost-effective analytical method. Front Microbiol. 2025;16:1710697. Published 2025 Nov 27. doi:10.3389/fmicb.2025.1710697
[4] Dera-Tomaszewska B., Salmonella serovars isolated for the first time in Poland, 1995-2007, International Journal of Occupational Medicine and Environmental Health 2012, 25(3):294-303..
[5] Thermo Fisher Scientific, Real-time PCR Detection of Salmonella spp. in Food and Environmental Samples Using spin-column–based DNA isolation methods
[6] ISO/TC 34/SC 9/WG 3, Overview of the ISO 16140 series.
