Automatyczne liczenie kolonii w mikrobiologii – CFU, analiza obrazu i walidacja

Automatyzacja analizy ilościowej w mikrobiologii hodowlanej

Ilościowa mikrobiologia hodowlana opiera się na założeniu, że żywe mikroorganizmy obecne w próbce, po naniesieniu na odpowiednie podłoże i inkubacji w zdefiniowanych warunkach, utworzą widoczne kolonie. Manualne liczenie jest metodą powszechną, ale czasochłonną, monotonną i podatną na zmienność międzylaboratoryjną oraz międzyoperatorową.

W badaniu Austerjost i wsp. automatyczna analiza obrazów płytek została porównana z liczeniem wykonywanym niezależnie przez dwóch badaczy, a autorzy wskazali potencjał cyfrowego przetwarzania obrazu do skrócenia czasu analizy i standaryzacji wyniku [1]. Automatyzacja może obejmować tylko etap liczenia, ale może także łączyć przygotowanie rozcieńczeń, inokulację, inkubację, identyfikację płytki, obliczenia CFU oraz transfer danych do systemu LIMS.

W tym ujęciu automatyzacja mikrobiologii jest procesem organizacyjnym i metrologicznym, a nie wyłącznie zakupem urządzenia.

CFU – jednostka wyniku i interpretacja

Co oznacza CFU?

CFU (colony-forming unit) jest operacyjną jednostką wyniku. Oznacza pojedynczą jednostkę biologiczną zdolną do utworzenia widocznej kolonii w danych warunkach posiewu i inkubacji. Tą jednostką może być pojedyncza komórka, para komórek, łańcuszek, skupisko, fragment grzybni lub inny agregat. Z tego powodu liczba kolonii nie jest tożsama z liczbą pojedynczych komórek.

Różnica ta ma kilka źródeł. Po pierwsze, komórki mogą pozostawać zlepione i tworzyć jedną kolonię. Po drugie, część komórek może być żywa, ale niezdolna do wzrostu w zastosowanym układzie hodowlanym. Po trzecie, warunki selektywne, temperatura, czas inkubacji, aktywność wody, dostęp tlenu i skład podłoża ograniczają frakcję wykrywaną. Po czwarte, kolonie sąsiadujące mogą się zlewać, przez co jedna struktura obrazu może reprezentować więcej niż jedną jednostkę początkową.

Wynik należy więc interpretować jako liczbę jednostek zdolnych do utworzenia kolonii w ściśle określonych warunkach. Standard EN ISO 4833-2 dotyczy oznaczania liczby mikroorganizmów metodą posiewu powierzchniowego i liczenia kolonii po inkubacji w 30 °C, jest to przykład metody o zdefiniowanym zakresie zastosowania, a nie uniwersalny pomiar wszystkich komórek obecnych w próbce [2].

Obliczanie CFU/mL i znaczenie rozcieńczeń

Dla klasycznego posiewu powierzchniowego podstawowy zapis ma postać

gdzie:

• N– liczba policzonych kolonii,
• V– objętość wysianej próbki w mL,
• d– rozcieńczenie próbki naniesionej na płytkę.

Analogicznie dla próbek stałych wynik może być wyrażany jako CFU/g z uwzględnieniem etapu homogenizacji. Rozcieńczenia seryjne służą doprowadzeniu liczby kolonii do zakresu, w którym kolonie są rozdzielone, a błąd względny nie jest nadmierny.

Zbyt mała liczba kolonii zwiększa niepewność wynikającą z losowości rozkładu, natomiast zbyt duża prowadzi do zlewania kolonii, konkurencji o składniki odżywcze i błędów segmentacji. W badaniu aplikacji mobilnej wykorzystano kilka poziomów rozcieńczeń, a wynik CFU/mL obliczano z liczby kolonii, współczynnika rozcieńczenia i objętości posiewu [1].

Posiew spiralny i porównanie metod liczenia kolonii

Posiew spiralny polega na nanoszeniu próbki na obracającą się płytkę wzdłuż spiralnego toru przy kontrolowanej, zwykle malejącej objętości dozowanej na jednostkę powierzchni. Ponieważ objętość zdeponowana w określonym obszarze jest znana, możliwe jest obliczenie stężenia na podstawie kolonii policzonych w wybranych strefach. Metoda spiralna tworzy na jednej płytce gradient powierzchniowego obciążenia próbki.

Klasyczna ocena Spiral Plate Maker wykazała wysoką korelację z metodami konwencjonalnymi oraz brak istotnych różnic między metodami na poziomie 5% w analizowanym układzie. Autorzy podali również, że zapotrzebowanie na pracę wynosiło około 31% wartości wymaganej przez jedną z metod konwencjonalnych, przy jednoczesnym ograniczeniu zużycia materiałów [3]. W badanym rozwiązaniu zakres około trzech rzędów wielkości mógł być analizowany na jednej płytce bez wykonywania pełnej serii rozcieńczeń, choć dla wyższych stężeń nadal konieczne było rozcieńczenie wstępne [3].

Porównanie tych metod ukazano w tabeli niżej:

Automatyczne liczenie kolonii i analiza obrazu AI

Automatyzacja interpretacji obrazu

Automatyczne liczenie kolonii może być stosowane zarówno do płytek przygotowanych klasycznie, jak i metodą spiralną; są to dwa niezależne poziomy automatyzacji: inokulacja oraz interpretacja obrazu. Automatyczny licznik kolonii zwykle obejmuje układ oświetlenia, kamerę, moduł wyznaczania obszaru płytki, algorytm segmentacji oraz funkcję zatwierdzania wyniku. W systemach półautomatycznych użytkownik ustawia parametry, takie jak średnica płytki, kontrast lub minimalny rozmiar kolonii, systemy w pełni automatyczne próbują wyznaczać te cechy bez ingerencji operatora [1]. Istotnym warunkiem jest powtarzalne pozyskiwanie obrazu, ponieważ niejednorodne oświetlenie, odbicia, kondensacja i napisy na płytce mogą prowadzić do błędów.

Analiza obrazu AI w mikrobiologii może rozszerzać klasyczne progowanie i segmentację o modele uczone na obrazach adnotowanych. Nie zmienia to jednak charakteru wyniku, algorytm klasyfikuje obiekty widoczne na obrazie, a poprawność wyniku zależy od reprezentatywności danych uczących oraz zgodności analizowanej próbki z zakresem walidacji. Model powinien być traktowany jak część metody pomiarowej, której wersja, ustawienia i zakres zastosowania są kontrolowane.

W badaniu Austerjost i wsp. średnia dokładność opracowanej aplikacji wynosiła 86,76 ± 9,76%, a średnie bezwzględne odchylenie od średniej liczenia manualnego wyniosło 13,24 ± 9,67%. Czas ręcznego liczenia przekraczał średnio 2 minuty, podczas gdy właściwe przetwarzanie automatyczne trwało maksymalnie 2 sekundy [1]. Dane te pokazują korzyść czasową, ale również konieczność ilościowej oceny błędu przed wdrożeniem.

Walidacja automatycznego liczenia kolonii

Zakres zastosowania i metoda odniesienia

Walidacja powinna odpowiadać rzeczywistemu zastosowaniu. Nie wystarczy potwierdzić, że system poprawnie liczy jedną kombinację drobnoustroju i podłoża.

Plan walidacji powinien obejmować co najmniej zakres zastosowania tj. lista matryc, podłoży, mikroorganizmów lub grup morfologicznych, średnic płytek, sposobów posiewu i warunków inkubacji. Niezależne liczenie manualne przez co najmniej dwóch kompetentnych analityków albo uzgodniona metoda referencyjna. Analiza regresji i wykres Bland–Altman są użyteczne do oceny błędu systematycznego i granic zgodności.

Dodatkowo wielokrotne odczyty tej samej płytki bez zmiany warunków, w tym ponowne ułożenie płytki i ponowne uruchomienie analizy. Różni operatorzy, dni, serie podłoża, partie płytek, urządzenia lub wersje oprogramowania, jeśli są objęte rutyną.

Zakres liczebności, morfologia i artefakty

Walidacja powinna obejmować płytki o małej, średniej i dużej liczbie kolonii, w tym próbki znajdujące się w pobliżu dolnej granicy oznaczalności oraz poziomu, przy którym kolonie zaczynają się zlewać i przestają być jednoznacznie rozróżnialne.

Należy również uwzględnić zróżnicowaną morfologię wzrostu, obejmującą kolonie małe i duże, barwne i bezbarwne, drożdże, pleśnie, kolonie nieregularne, rozlewne oraz stykające się.

Istotnym elementem oceny jest odporność systemu na artefakty, takie jak:

• pęcherzyki powietrza,
• rysy,
• kondensacja,
• napisy,
• etykiety,
• nierówna powierzchnia podłoża,
• odbicia światła
• i zanieczyszczenia tła.

Poprawność obliczeń, kryteria akceptacji i kontrola zmian

Walidacja powinna także potwierdzać poprawność obliczeń, w tym prawidłowe stosowanie współczynników rozcieńczenia, objętości posiewu, przeliczeń CFU/mL lub CFU/g oraz zasad łączenia wyników z kilku płytek. Kryteria akceptacji należy określić z góry, definiując dopuszczalny bias, precyzję, odsetek wyników wymagających ręcznej korekty oraz maksymalny błąd w zależności od liczby kolonii.

Po każdej istotnej zmianie, takiej jak wymiana kamery, modyfikacja oświetlenia, aktualizacja algorytmu lub modelu AI, zmiana wersji oprogramowania, podłoża, sposobu przygotowania próbki albo kryteriów analizy, konieczna jest ponowna ocena wpływu tej zmiany na wynik. W przypadku metody spiralnej walidacja powinna dodatkowo obejmować dokładność i precyzję dozowania, geometrię toru spirali, zgodność objętości przypisanych poszczególnym strefom oraz poprawność wyboru obszaru liczenia.

Dla automatycznego liczenia kolonii należy oceniać nie tylko zgodność łącznej liczby kolonii z wynikiem referencyjnym, lecz także rodzaj popełnianych błędów, w szczególności wykrywanie obiektów fałszywie dodatnich, pomijanie rzeczywistych kolonii, nieprawidłowe rozdzielanie skupisk oraz błędne wykluczanie fragmentów powierzchni płytki [2].

Audytowalność i integralność danych

Rekord wyniku i ścieżka audytu

Wynik ilościowy powinien być audytowalny, czyli możliwy do odtworzenia na podstawie zapisanych danych źródłowych i historii operacji. Minimalny pakiet rekordu powinien obejmować identyfikator próbki i płytki, obraz pierwotny, obraz z oznaczeniem wykrytych kolonii, datę i czas analizy, użytkownika, wersję oprogramowania lub modelu, parametry analizy, liczbę obiektów dodanych i usuniętych ręcznie, współczynnik rozcieńczenia, objętość posiewu, wynik CFU oraz status zatwierdzenia.

Archiwizacja obrazu jest szczególnie ważna, ponieważ umożliwia ponowną ocenę bez fizycznego przechowywania płytki przez cały okres retencji danych. Obraz źródłowy nie powinien być nadpisywany po ręcznej korekcie. Zmiany powinny być rejestrowane w ścieżce audytu, wraz z identyfikatorem osoby, znacznikiem czasu i w środowisku regulowanym, uzasadnieniem.

Ręczna weryfikacja wyjątków

Ręczna weryfikacja wyjątków nie jest wadą automatyzacji, lecz elementem bezpiecznego procesu. System powinien kierować do operatora płytki z niepewnym wynikiem, koloniami zlewającymi się, wzrostem rozlewnym, nietypową morfologią, silną kondensacją, niepełnym polem widzenia lub liczbą kolonii poza zwalidowanym zakresem.

Dobrą praktyką jest utrzymanie dwupoziomowego procesu, tzn. automatyczna propozycja wyniku oraz zatwierdzenie przez kompetentnego użytkownika.

Materiały producenta przykładowego systemu Scan Ai opisują funkcje zapisu i eksportu wyników, ścieżki audytu, lokalnego przechowywania danych, wielopoziomowego dostępu oraz podwójnego podpisu elektronicznego [4]. Są to cechy konkretnej implementacji i wymagają potwierdzenia podczas kwalifikacji oraz walidacji w danym laboratorium.

Scan Ai – deklaracje producenta a zasady ogólne

Należy jednoznacznie oddzielać zasady ogólne od deklaracji producenta. Zasady ogólne obejmują definicję CFU, wymóg reprezentatywnego posiewu, wpływ rozcieńczenia, potrzebę rozdzielenia kolonii, konieczność walidacji, ocenę zgodności z metodą odniesienia oraz zapewnienie integralności danych. Są one niezależne od marki urządzenia.

Parametry konkretnego urządzenia obejmują natomiast rozdzielczość kamery, czas odczytu, maksymalną liczbę analizowanych kolonii, deklarowaną dokładność, obsługiwane średnice płytek, rodzaje podłoży, tryby oświetlenia, sposób integracji z LIMS i funkcje podpisu elektronicznego. Przykładowa broszura producenta deklaruje dla serii Scan Ai m.in. liczenie w około 1 sekundę, dokładność do 98%, analizę całej powierzchni płytki, rozpoznawanie artefaktów oraz funkcje śledzenia wyniku [4].

Deklaracje te nie powinny być traktowane jako uniwersalne właściwości każdego automatycznego licznika kolonii ani jako zastępstwo walidacji dla konkretnej metody laboratoryjnej. Poniższy schemat przedstawia kolejne etapy wdrożenia automatycznego liczenia kolonii od określenia zakresu zastosowania i przygotowania materiału walidacyjnego, przez porównanie z metodą odniesienia, aż po ocenę zgodności, zapewnienie integralności danych i kontrolę zmian. Celem procesu jest potwierdzenie, że system generuje wyniki wiarygodne, powtarzalne i audytowalne w rzeczywistych warunkach pracy laboratorium.

Wdrożenie automatycznego liczenia kolonii

Automatyzacja, posiew spiralny i rola eksperta

Automatyzacja skraca czas pracy i ogranicza wpływ zmęczenia operatora, ale przenosi część ryzyka z człowieka na konfigurację systemu, jakość obrazu i zakres danych walidacyjnych. Największe korzyści występują w laboratoriach o dużej liczbie płytek, powtarzalnych metodach i dobrze zdefiniowanych kryteriach oceny. W laboratoriach analizujących bardzo zróżnicowane matryce lub rzadkie morfologie kolonii potrzebny jest większy udział eksperta.

Posiew spiralny i automatyczne liczenie są rozwiązaniami komplementarnymi. Pierwszy ogranicza liczbę rozcieńczeń i płytek przez kontrolowane utworzenie gradientu inokulum, drugi automatyzuje interpretację obrazu. Połączenie obu technologii może zwiększyć przepustowość, jednak walidacja musi objąć cały łańcuch: dozowanie, wzrost kolonii, obrazowanie, algorytm, obliczenia oraz raportowanie.

Automatyczne liczenie kolonii zwiększa szybkość i standaryzację, ale jego wiarygodność zależy od walidacji dla własnych matryc, podłoży, mikroorganizmów i zakresów stężeń.