Monitoring higieny powierzchni metodą ATP – jak interpretować wyniki RLU?

Czym jest ATP i dlaczego jego obecność wskazuje na pozostałości biologiczne?

Adenozynotrifosforan, określany skrótem ATP, jest związkiem uczestniczącym w magazynowaniu i przekazywaniu energii we wszystkich żywych komórkach. Występuje zarówno w komórkach zwierzęcych i roślinnych, jak i w bakteriach, drożdżach oraz grzybach. Z tego względu obecność ATP na powierzchni może świadczyć o pozostawieniu materiału pochodzenia biologicznego, takiego jak resztki surowców, produktów spożywczych, płynów ustrojowych lub biomasy mikroorganizmów [1, 3, 5]. W środowisku produkcyjnym większość sygnału ATP nie musi pochodzić z drobnoustrojów. Szczególnie duże ilości tego związku mogą znajdować się w pozostałościach mięsa, mleka, warzyw, owoców, soków, drożdży i innych produktów zawierających żywe lub niedawno uszkodzone komórki. Wysoki wynik po zakończeniu mycia wskazuje więc przede wszystkim, że materiał biologiczny nie został skutecznie usunięty. Jest to istotne także wtedy, gdy pozostałości nie zawierają dużej liczby mikroorganizmów, ponieważ mogą chronić komórki przed działaniem środków dezynfekcyjnych, dostarczać im składników odżywczych oraz sprzyjać rozwojowi biofilmów [2, 3]. ATP nie wykrywa bezpośrednio mikroorganizmów i nie identyfikuje ich gatunków. Pomiar ATP jest szybką metodą oceny ogólnego poziomu zanieczyszczenia biologicznego powierzchni i skuteczności procesu czyszczenia, a nie badaniem mikrobiologicznym.

Jak działa pomiar ATP? Reakcja bioluminescencyjna

Pomiar ATP opiera się na reakcji bioluminescencyjnej wykorzystującej lucyferynę i enzym lucyferazę. W obecności ATP, tlenu i jonów magnezu lucyferyna ulega enzymatycznemu utlenieniu, któremu towarzyszy emisja światła. ATP pełni w tej reakcji funkcję źródła energii, dlatego ilość emitowanego światła jest, w zakresie roboczym danego testu, proporcjonalna do ilości ATP znajdującego się w pobranej próbce [1, 5].

Czym są jednostki RLU i jak je interpretować?

Światło jest rejestrowane przez luminometr ATP, który przekształca sygnał optyczny w wynik wyrażony w jednostkach RLU, czyli Relative Light Units. RLU są jednostkami względnymi, charakterystycznymi dla określonego systemu pomiarowego. Nie odpowiadają bezpośrednio konkretnej masie ATP ani liczbie mikroorganizmów. Na wynik wpływają między innymi czułość detektora, konstrukcja wymazówki, skład i ilość odczynników, wydajność uwalniania ATP, temperatura testu, czas od aktywacji do odczytu oraz sposób przeliczania sygnału przez oprogramowanie urządzenia [1, 3]. Z tego względu rezultatów otrzymanych za pomocą różnych luminometrów, testów lub odczynników nie należy porównywać bez wcześniejszego potwierdzenia ich równoważności. Wartość 100 RLU uzyskana w jednym systemie może odpowiadać innemu poziomowi zanieczyszczenia niż 100 RLU zmierzone za pomocą urządzenia innego producenta. RLU powinny być zatem interpretowane zawsze w odniesieniu do własnej metody, konkretnej powierzchni i danych historycznych.

Co mierzy metoda ATP, a czego nie można ustalić na podstawie wyniku?

Metoda ATP odpowiada przede wszystkim na pytanie, czy po wykonaniu procedury mycia na powierzchni pozostała wykrywalna ilość materiału biologicznego. Dzięki temu może być stosowana jako element kontroli czystości powierzchni oraz bieżącej weryfikacji mycia i dezynfekcji. Pomiar umożliwia ujawnienie niedokładnego usunięcia produktu, pominięcia fragmentu urządzenia, niewłaściwej techniki czyszczenia, zużycia elementów wyposażenia albo pogarszającej się powtarzalności procesu.

Wynik ATP nie informuje jednak, jaki rodzaj materiału był źródłem sygnału. Test nie odróżnia ATP pochodzącego z bakterii od ATP obecnego w resztkach żywności. Nie pozwala również określić liczby jednostek tworzących kolonie, wykryć konkretnego patogenu, rozpoznać gatunku mikroorganizmu ani ocenić obecności określonego alergenu lub toksyny [3, 5].

Zależność między wartością RLU a liczbą drobnoustrojów nie jest stała. Wysokie RLU mogą występować na powierzchni zawierającej dużo pozostałości produktu, ale stosunkowo niewiele zdolnych do wzrostu bakterii. Możliwa jest również sytuacja odwrotna, w której wynik ATP jest niski, mimo że na powierzchni znajdują się mikroorganizmy. Może to wynikać z niewielkiej ilości ATP w komórkach, ich stanu fizjologicznego, obecności przetrwalników, niepełnego uwolnienia ATP albo liczby komórek pozostającej poniżej czułości testu. Z tego powodu ATP nie powinno być stosowane jako zamiennik metod mikrobiologicznych [3].

Pomiar ATP a klasyczny wymaz mikrobiologiczny

Klasyczne badania mikrobiologiczne dostarczają informacji o liczbie hodowalnych mikroorganizmów, ale ich wynik jest dostępny z opóźnieniem. Pomiar ATP umożliwia natomiast podjęcie decyzji bezpośrednio po zakończeniu mycia, jeszcze przed rozpoczęciem produkcji. Obie metody mają więc odmienny cel i powinny być wykorzystywane komplementarnie [2, 7].

Jak wybierać punkty pomiarowe i ustalać częstotliwość pomiarów ATP?

Program monitoringu higieny ATP powinien wynikać z analizy ryzyka, a nie z przypadkowego wyboru łatwo dostępnych powierzchni. Największe znaczenie mają miejsca bezpośrednio kontaktujące się z produktem, szczególnie po etapach ograniczających liczbę drobnoustrojów, a także elementy trudne do demontażu i czyszczenia. Do takich obszarów należą między innymi uszczelki, zawory, spoiny, narożniki, prowadnice, połączenia elementów, powierzchnie zarysowane oraz przestrzenie, w których może gromadzić się produkt. W programie należy również uwzględnić powierzchnie często dotykane przez personel, takie jak uchwyty, panele sterujące i przyciski, zwłaszcza gdy mogą one uczestniczyć w przenoszeniu zanieczyszczeń pomiędzy strefami. Szczególnego nadzoru wymagają punkty, w których wcześniej notowano wysokie lub niestabilne wartości RLU. Badania wskazują, że analiza wyników ATP pozwala identyfikować miejsca, w których proces mycia jest najmniej powtarzalny i które powinny być kontrolowane częściej [3]. Częstotliwość pomiarów powinna być proporcjonalna do ryzyka, częstotliwości użytkowania urządzenia oraz stabilności procesu. Powierzchnie kontaktujące się z produktem gotowym do spożycia mogą wymagać kontroli po każdym cyklu mycia, natomiast stabilne punkty o niższym znaczeniu mogą być objęte planem rotacyjnym. Liczbę badań należy zwiększać po zmianie detergentu, modernizacji linii, wprowadzeniu nowego produktu, wystąpieniu awarii, wyniku niezgodnego albo zmianie zespołu odpowiedzialnego za czyszczenie. Porównywalność danych wymaga pobierania próbek w takim samym momencie procesu. Najczęściej badanie prowadzi się po zakończeniu mycia i wymaganym czasie osuszenia, ale przed uruchomieniem produkcji. Lokalizacja, pole powierzchni, moment pobrania oraz technika wymazu muszą być jednoznacznie określone w procedurze. Zasada ta jest zgodna z ogólnymi wymaganiami standaryzacji pobierania próbek z powierzchni opisanymi w ISO 18593:2018 [6].

Jak ustalać limity RLU pass, caution i fail na podstawie własnych danych?

Limity RLU nie powinny być bezkrytycznie kopiowane z materiałów producenta ani dokumentacji innego zakładu. Uniwersalna wartość odpowiednia dla wszystkich powierzchni nie istnieje, ponieważ wynik zależy od zastosowanego systemu pomiarowego, rodzaju produktu, materiału powierzchni, jej wieku i stanu technicznego, sposobu mycia oraz możliwego do osiągnięcia poziomu czystości [3, 5]. Podstawą ustalenia limitów powinny być własne dane bazowe, określane jako baseline. Przed ich gromadzeniem należy ustandaryzować proces mycia, moment pobierania próbki, badane pole oraz technikę wykonywania wymazu. Powierzchnie wykorzystywane do budowy baseline powinny zostać uznane za prawidłowo umyte na podstawie kontroli wykonania procedury, oceny wzrokowej i okresowych badań mikrobiologicznych. Dopiero wyniki pochodzące z potwierdzonego, skutecznego procesu mogą stanowić podstawę ustalenia kryteriów. Dla każdego punktu należy zebrać odpowiednio dużą liczbę pomiarów po prawidłowo wykonanym myciu. W praktyce warto zgromadzić co najmniej kilkadziesiąt wyników obejmujących różne dni, zmiany i partie produkcyjne. Ponieważ rozkład RLU jest często niesymetryczny i zawiera pojedyncze bardzo wysokie wartości, analiza nie powinna ograniczać się do średniej. Przydatne są również mediana, percentyle, zakres zmienności i wartości po transformacji logarytmicznej. Granica pass powinna odpowiadać poziomowi rutynowo osiąganemu po skutecznym myciu. Strefa caution powinna sygnalizować pogorszenie stabilności procesu i konieczność powtórzenia pomiaru RLU danego punku krytycznego, natomiast fail, wskazywać, że powierzchnia wymaga ponownego czyszczenia. W literaturze opisywano ustalanie dolnej granicy na podstawie średniej, mediany, określonego percentyla albo wartości obejmującej około 80% wyników uzyskanych po prawidłowym myciu. Granicę fail wyznaczano niekiedy jako trzykrotność limitu dolnego lub jako średnią powiększoną o trzy odchylenia standardowe. Są to jednak wyłącznie możliwe sposoby analizy, a nie gotowe kryteria dla każdego zakładu [3]. Limity powinny być ustalane osobno dla powierzchni różniących się materiałem, konstrukcją i poziomem ryzyka. Gładka stal nierdzewna może wykazywać znacznie niższe i bardziej stabilne wyniki niż porysowane tworzywo, guma lub drewno. Zaostrzone kryteria są zwykle uzasadnione w punktach kontaktujących się z produktem po obróbce cieplnej, natomiast dla powierzchni środowiskowych można przyjąć inne wartości.

Kiedy należy ponownie ocenić limity RLU?

Po zebraniu większej liczby danych limity należy ponownie ocenić. Zbyt wysoka granica może utrwalać niewłaściwy poziom czystości, natomiast granica nadmiernie restrykcyjna prowadzi do częstych, nieuzasadnionych powtórzeń mycia i może obniżać zaangażowanie personelu oraz niezasadnie zwiększać koszty mycia. Kryteria powinny być aktualizowane również po zmianie luminometru, rodzaju wymazówki, detergentu, materiału powierzchni lub procedury czyszczenia.

Jak prawidłowo pobierać wymaz ATP z powierzchni?

Wiarygodność pomiaru w dużej mierze zależy od sposobu pobrania próbki. Różnice w nacisku, liczbie ruchów, powierzchni pobrania i obracaniu końcówki wymazówki mogą powodować znaczną zmienność wyników, nawet jeżeli rzeczywisty stan powierzchni pozostaje taki sam. Procedura powinna zatem określać wielkość badanego pola, kierunki ruchów i moment wykonania pomiaru. Na płaskich powierzchniach można stosować stałe pole, przykładowo 10 × 10 cm, o ile jest to zgodne z instrukcją testu. Wymazówkę należy prowadzić równoległymi ruchami w dwóch prostopadłych kierunkach, równocześnie obracając jej końcówkę, aby wykorzystać całą powierzchnię materiału pobierającego. W przypadku małych elementów każdorazowo należy badać ten sam, dokładnie określony obszar albo całą dostępną powierzchnię. W jednym z badań zastosowano jałowy szablon o powierzchni 25 cm², co umożliwiało zachowanie porównywalności pomiarów [1].

Błędy pomiaru i czynniki wpływające na wynik ATP

Typowe błędy podczas pobierania wymazu ATP, aktywacji testu i wykonywania pomiaru

Do typowych błędów należy pobieranie próbek z powierzchni o różnej wielkości, zbyt delikatne wymazywanie, omijanie narożników, dotykanie końcówki ręką, pobranie z nieustalonego miejsca oraz wykonywanie badania w różnym czasie po myciu. Problemem może być również badanie powierzchni pokrytej dużą ilością wody, jeżeli metoda nie została zwalidowana dla takich warunków. Woda może rozcieńczać próbkę, przenosić ATP pomiędzy obszarami lub wpływać na odzysk materiału. Błędy mogą wystąpić także podczas aktywacji testu. Niepełne uwolnienie odczynnika, niedostateczne wymieszanie, niewłaściwe umieszczenie wymazówki w komorze albo zmienny czas między aktywacją a pomiarem prowadzą do wyników nieporównywalnych. Test powinien być przechowywany w zalecanej temperaturze i używany przed upływem terminu ważności. Po aktywacji należy go wymieszać oraz zmierzyć dokładnie w sposób i w czasie określonym przez producenta.

Wpływ detergentów i preparatów dezynfekcyjnych na wynik ATP

Pozostałości detergentów oraz preparatów dezynfekcyjnych mogą wpływać na reakcję bioluminescencyjną. Niektóre substancje hamują aktywność lucyferazy, ograniczają uwalnianie ATP lub destabilizują reakcję, prowadząc do wyniku zaniżonego. Inne mogą zwiększać tło pomiarowe i powodować wartości pozornie podwyższone. Kierunek i skala interferencji zależą od substancji czynnej, stężenia resztkowego, rodzaju testu i sposobu pobrania próbki [3].

Zmiana preparatu chemicznego powinna być zatem traktowana jako zmiana mogąca wpływać na metodę pomiarową. Wskazane jest wykonanie prostego badania odzysku, w którym znaną ilość materiału zawierającego ATP oznacza się bez obecności preparatu oraz w obecności jego przewidywanego stężenia resztkowego. Znaczna różnica między wynikami może świadczyć o interferencji i wymagać modyfikacji czasu pobierania próbki, dokładniejszego płukania albo zastosowania testu o potwierdzonej odporności na daną substancję. Próbki powinny być pobierane w jednolitym momencie po zakończeniu procesu. Jeżeli procedura przewiduje płukanie powierzchni, należy potwierdzić jego skuteczność. Jeżeli preparat pozostaje na powierzchni bez spłukiwania, kompatybilność z testem ATP powinna zostać oceniona podczas walidacji programu.

Znaczenie materiału i stanu powierzchni

Materiał powierzchni wpływa zarówno na gromadzenie zanieczyszczeń, jak i na skuteczność ich pobierania. Gładka stal nierdzewna jest zazwyczaj łatwiejsza do umycia i wymazania niż guma, drewno, porowate tworzywo lub powierzchnia skorodowana. Zarysowania, pęknięcia i wżery mogą zatrzymywać produkt, wodę i mikroorganizmy, a równocześnie ograniczać kontakt końcówki wymazówki z zanieczyszczeniem. Wysokie lub zmienne RLU w jednym punkcie nie zawsze świadczą wyłącznie o błędzie pracownika. Mogą sygnalizować pogorszenie stanu technicznego urządzenia, zużycie uszczelki, uszkodzenie spoiny albo konstrukcję uniemożliwiającą skuteczne czyszczenie. Dane ATP mogą więc wspierać nie tylko nadzór nad personelem, lecz również decyzje dotyczące konserwacji i wymiany wyposażenia. Wyników uzyskanych na różnych materiałach nie należy oceniać według jednego limitu bez wcześniejszego potwierdzenia, że powierzchnie wykazują podobny odzysk ATP i porównywalną zmienność. Limity przypisane do poszczególnych punktów lub jednorodnych grup powierzchni są zwykle bardziej miarodajne niż jedno kryterium dla całego obiektu.

Jak analizować trendy RLU, odchylenia i skuteczność działań korygujących?

Pojedynczy wynik informuje o stanie powierzchni w chwili badania, jednak największą wartość programu ATP uzyskuje się dzięki analizie zmian w czasie. Należy obserwować nie tylko liczbę wyników fail, ale również medianę RLU, udział wyników caution, rozrzut danych i stopniowe przesuwanie się wyników w kierunku górnej granicy.

Przykład interpretacji rosnącego trendu RLU

Przykładem może być uszczelka dozownika, dla której ustalono wynik pass do 100 RLU, caution od 101 do 300 RLU i fail powyżej 300 RLU. Jeżeli kolejne tygodniowe mediany wynoszą 42, 58, 79, 96, 145 i 210 RLU, początkowo większość wyników może nadal spełniać wymagania. Widoczny jest jednak systematyczny wzrost, który wskazuje na pogarszanie się procesu. Oczekiwanie na przekroczenie wartości fail oznaczałoby zbyt późną reakcję. Analiza przyczyny może wykazać, że w mikropęknięciach zużytej uszczelki gromadzi się produkt. W takiej sytuacji właściwe działanie obejmuje demontaż i dokładne doczyszczenie elementu, jego wymianę, modyfikację instrukcji mycia oraz czasowe zwiększenie częstotliwości pomiarów. Skuteczność działania należy potwierdzić serią stabilnych wyników uzyskanych w kolejnych cyklach, a nie jednym pomiarem wykonanym bezpośrednio po interwencji. Powtarzające się wyniki niezgodne powinny prowadzić do analizy przyczyny źródłowej. Należy ustalić, czy problem dotyczy techniki pracownika, niedostatecznego czasu kontaktu środka chemicznego, niewłaściwego stężenia, temperatury wody, konstrukcji urządzenia, zużycia części, zbyt długiego czasu pomiędzy produkcją a myciem albo nieprawidłowej kolejności czynności. Samo powtarzanie mycia bez usunięcia przyczyny nie zapewnia trwałej poprawy.

Pomiar ATP i badania mikrobiologiczne – metody komplementarne w kontroli higieny

ATP, badania mikrobiologiczne, ocena wzrokowa oraz testy alergenowe dostarczają różnych informacji. Ocena wzrokowa pozwala rozpoznać widoczne zabrudzenia, lecz nie wykrywa cienkich warstw produktu ani niewidocznych pozostałości biologicznych. ATP informuje o obecności materiału biologicznego, ale nie wskazuje jego rodzaju. Badania mikrobiologiczne określają liczbę hodowalnych mikroorganizmów lub obecność określonych grup, natomiast testy alergenowe wykrywają konkretne białka. W praktyce ATP może być stosowane często, nawet po każdym cyklu mycia, ponieważ wynik jest dostępny natychmiast. Badania mikrobiologiczne wykonuje się okresowo, aby walidować program higieniczny, kontrolować organizmy wskaźnikowe i monitorować obecność zagrożeń biologicznych. W środowiskach wysokiego ryzyka uzupełnieniem są badania ukierunkowane na patogeny oraz odpowiednio zaprojektowany monitoring środowiskowy. W badaniu prowadzonym przez osiem miesięcy w stołówce uniwersyteckiej pomiar ATP i tradycyjne analizy mikrobiologiczne stosowano równolegle. Metoda ATP okazała się przydatna do bieżącej oceny prawidłowości procedur sanitarnych, ale autorzy podkreślili, że nie może zastępować oznaczania liczby drobnoustrojów na powierzchniach [7]. Rozbieżność między RLU a CFU nie musi oznaczać błędu. Wysokie RLU przy niskiej liczbie CFU mogą świadczyć o pozostawieniu produktu mimo skutecznej dezynfekcji. Niskie RLU i podwyższona liczba CFU mogą natomiast wystąpić wtedy, gdy ilość ATP pochodząca z drobnoustrojów pozostaje poniżej progu wykrywania albo uwolnienie ATP z komórek jest niepełne. Interpretacja powinna uwzględniać cel i ograniczenia obu metod.

Monitoring ATP z wykorzystaniem EnSURE Touch i SureTrend Cloud

Program wykorzystujący EnSURE Touch i SureTrend rozpoczyna się od utworzenia struktury odpowiadającej organizacji zakładu. W systemie definiuje się obiekty, obszary, linie, urządzenia i poszczególne punkty pobierania próbek. Każdy punkt powinien mieć jednoznaczną nazwę, która pozwala wskazać konkretną powierzchnię bez ryzyka pomyłki. Określenie „nóż krajalnicy od strony kontaktu z produktem” jest bardziej użyteczne niż ogólne oznaczenie „krajalnica”. Do punktów przypisuje się harmonogramy oraz ustalone na podstawie własnych danych limity pass, caution i fail. Operator wybiera odpowiedni plan na ekranie urządzenia, wykonuje wymaz ATP ze zdefiniowanego pola, aktywuje test zgodnie z instrukcją i umieszcza go w komorze pomiarowej. EnSURE Touch rejestruje wynik RLU, przypisuje go do wybranego punktu i automatycznie klasyfikuje według zapisanych kryteriów. Wynik pass oznacza, że punkt spełnia ustalone wymagania ATP, o ile równocześnie nie występują inne przesłanki wskazujące na nieprawidłowość. Wynik caution powinien prowadzić do oceny przyczyny, ponieważ może sygnalizować pogarszanie się procesu. Wynik fail oznacza konieczność niedopuszczenia powierzchni do użytkowania, powtórzenia mycia i wykonania ponownego pomiaru. Po synchronizacji dane są przenoszone do SureTrend Cloud, gdzie można analizować wyniki według punktu, obszaru, urządzenia, użytkownika lub okresu. System umożliwia obserwowanie trendów, porównywanie lokalizacji, przygotowywanie raportów i dokumentowanie działań korygujących. Szczególną uwagę należy zwracać na punkty wykazujące częste wyniki caution, rosnącą medianę lub dużą zmienność, nawet jeżeli liczba formalnych wyników fail jest niewielka. Prawidłowe zamknięcie odchylenia nie powinno ograniczać się do uzyskania poprawnego wyniku po ponownym myciu. Należy udokumentować wynik początkowy, przeprowadzone działanie, wynik kontrolny oraz przy problemach powtarzających się, przyczynę źródłową i działanie zapobiegawcze.

Monitoring higieny ATP – podsumowanie

Monitoring higieny ATP jest szybkim i użytecznym narzędziem do bieżącej oceny skuteczności usuwania zanieczyszczeń biologicznych z powierzchni. Umożliwia uzyskanie wyniku bezpośrednio po zakończeniu mycia, a tym samym przeprowadzenie działania korygującego przed rozpoczęciem produkcji. Metoda nie wykrywa jednak bezpośrednio mikroorganizmów, nie rozpoznaje ich gatunków i nie pozwala na wiarygodne przeliczenie wartości RLU na CFU. O wartości programu decyduje przede wszystkim jego prawidłowe zaprojektowanie. Najważniejsze znaczenie mają wybór punktów na podstawie ryzyka, standaryzacja wymazu, kontrola interferencji, budowa własnych limitów pass/caution/fail oraz analiza wyników w czasie. ATP, klasyczne badania mikrobiologiczne, monitoring środowiskowy i testy swoiste powinny być traktowane jako metody komplementarne. Dopiero ich odpowiednie połączenie pozwala ocenić zarówno skuteczność procesu mycia, jak i rzeczywisty poziom zagrożenia mikrobiologicznego.