Nadzór nad alergenami w systemie zarządzania ryzykiem

Skuteczny nadzór nad alergenami nie może ograniczać się wyłącznie do badania produktu końcowego [1]. Obecność alergenu w żywności może być wynikiem nie tylko celowego zastosowania określonego składnika, lecz także zanieczyszczenia krzyżowego powstającego podczas transportu, magazynowania, produkcji, czyszczenia, przepływu personelu, wykorzystania reworku lub zmiany materiałów opakowaniowych. Z tego względu badanie alergenów w żywności powinno być elementem szerszego systemu zarządzania ryzykiem, obejmującego cały cykl produkcyjny. Takie podejście odpowiada zasadom Codex CXC 80-2020, zgodnie z którymi kontrola alergenów powinna być zintegrowana z systemem higieny, dobrymi praktykami produkcyjnymi oraz analizą zagrożeń [2].

Badanie wyłącznie gotowej partii ma ograniczoną wartość prewencyjną. Próbka laboratoryjna reprezentuje jedynie niewielką część produktu, natomiast zanieczyszczenie krzyżowe może być nierównomierne i występować punktowo. Pozostałości alergenu mogą koncentrować się w uszczelkach, zaworach, przewodach, głowicach dozujących, na taśmach transportowych lub w pierwszych jednostkach produktu wytwarzanych po zmianie asortymentu. Ujemny wynik pojedynczej próbki nie dowodzi zatem całkowitego braku alergenu w całej partii lub instalacji. Zasadniczym celem monitoringu alergenów powinno być zapobieganie niekontrolowanemu kontaktowi, a badania analityczne powinny potwierdzać skuteczność zastosowanych zabezpieczeń. Podstawowym aktem prawnym regulującym informowanie konsumentów o alergenach w Unii Europejskiej jest rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011. Załącznik II tego rozporządzenia obejmuje czternaście grup substancji lub produktów powodujących alergie albo reakcje nietolerancji. Są to zboża zawierające gluten, skorupiaki, jaja, ryby, orzeszki ziemne, soja, mleko, określone gatunki orzechów, seler, gorczyca, sezam, dwutlenek siarki i siarczyny powyżej wskazanego stężenia, łubin oraz mięczaki [1]. W wykazie składników nazwa alergenu musi być jednoznacznie wyróżniona typograficznie, na przykład za pomocą pogrubienia, odmiennego kroju pisma lub tła. Jeżeli produkt nie ma wykazu składników, stosuje się określenie „zawiera”, po którym podaje się nazwę odpowiedniej substancji lub produktu. Obowiązek ten dotyczy składników celowo zastosowanych, dlatego nie zastępuje oceny ryzyka związanego z niezamierzoną obecnością alergenu.

Mapa ryzyka w zakładzie

Systemowa kontrola alergenów powinna rozpoczynać się od sporządzenia mapy ryzyka. Obejmuje ona ocenę surowców i dostawców, warunków magazynowania, kierunków transportu wewnętrznego, harmonogramu produkcji, zasad stosowania reworku, organizacji pracy personelu, wyposażenia pomocniczego, skuteczności czyszczenia oraz poprawności etykietowania. Szczególne znaczenie ma kwalifikacja dostawców i aktualność specyfikacji surowców. Zakład powinien znać zarówno alergeny celowo obecne w materiale, jak i ryzyko ich niezamierzonego występowania u dostawcy. Zmiana receptury, miejsca produkcji lub źródła surowca powinna prowadzić do ponownej oceny zagrożenia. W magazynach i na obszarach dozowania istotne jest ograniczenie rozsypywania i pylenia surowców alergennych. Szczególnego nadzoru wymagają mąki, proszki mleczne, jaja w proszku, sezam, orzechy oraz mieszanki przypraw. Powinny być one właściwie oznaczone, zabezpieczone i przechowywane w sposób ograniczający ich kontakt z pozostałymi materiałami. Podobne zasady dotyczą pojemników, łopatek, wózków i innych narzędzi. Harmonogram produkcji powinien uwzględniać nie tylko skład receptury, lecz także właściwości produktu, takie jak pylenie, lepkość, zawartość tłuszczu i podatność na odkładanie się na urządzeniach. W praktyce często stosuje się kolejność produkcji od wyrobów niezawierających danego alergenu do produktów, w których jest on obecny, jednak skuteczność takiego rozwiązania musi wynikać z analizy konkretnego procesu.

Plan próbkowania w monitoringu alergenów

Plan próbkowania powinien wynikać z analizy ryzyka i być powiązany z jasno określonym celem. Próbki mogą obejmować surowce, produkt w toku, pierwsze jednostki po zmianie asortymentu, produkt końcowy, wymazy środowiskowe, wodę popłuczną oraz próbki z punktów najtrudniejszych do czyszczenia. W przypadku ryzyka nierównomiernego zanieczyszczenia większą wartość mogą mieć liczne próbki punktowe niż jedna próbka zbiorcza, ponieważ homogenizacja może rozcieńczyć lokalne nagromadzenie alergenu. Wymazy powierzchniowe powinny być pobierane według ustandaryzowanej procedury. Należy określić wielkość badanej powierzchni, kierunek i sposób wymazu, rodzaj materiału oraz warunki, w jakich powierzchnia była mokra lub sucha. Wyniki mogą być porównywane w czasie tylko wtedy, gdy sposób pobierania jest powtarzalny. W badaniu walidacyjnym testu LFT do orzeszków ziemnych oceniano wymazy ze stali nierdzewnej i tworzyw sztucznych oraz próbki pobierane z powierzchni mokrych i suchych. Test umożliwiał również analizę popłuczyn z instalacji CIP [4].

Woda popłuczna

Woda popłuczna jest szczególnie użyteczna w instalacjach zamkniętych, w których pobranie wymazu nie jest możliwe. Jej badanie może wykazać, czy z układu nadal wypłukiwane są pozostałości alergenu. Nie należy jednak traktować ujemnego wyniku popłuczyn jako bezpośredniego dowodu czystości wszystkich powierzchni. Resztki mogą pozostać w strefach o ograniczonym przepływie, pod uszczelkami lub w osadach. Ponadto zgodność testu z chemicznym składem popłuczyn musi zostać potwierdzona. W walidacji testu do orzeszków ziemnych badano wodę oraz roztwory zawierające kwas nadoctowy, nadtlenek wodoru i czwartorzędowe związki amoniowe, co pokazuje, że obecność środków myjących i dezynfekcyjnych może mieć znaczenie dla wiarygodności wyniku [4].

Testy ELISA w badaniu alergenów

W monitoringu alergenów najczęściej wykorzystuje się metody immunochemiczne, wśród których szczególne znaczenie mają ELISA i LFT. Obie technologie opierają się na swoistym wiązaniu przeciwciała z białkiem pochodzącym z alergennego surowca, lecz różnią się sposobem prowadzenia analizy, zakresem zastosowań i charakterem uzyskiwanego wyniku. ELISA jest metodą immunoenzymatyczną stosowaną głównie wtedy, gdy potrzebny jest wynik ilościowy lub półilościowy. W popularnym formacie kanapkowym białko alergenne zostaje związane przez przeciwciało unieruchomione w mikrostudzienkach, a następnie przez drugie przeciwciało znakowane enzymem. Po dodaniu substratu powstaje sygnał barwny, którego intensywność mierzy się fotometrycznie. Stężenie obliczane jest na podstawie krzywej kalibracyjnej. Wynik może być wyrażony jako mg/kg produktu, ppm białka, ppm białka rozpuszczalnego lub równoważnik surowca. Jednostki te nie są tożsame, dlatego przed interpretacją należy ustalić, w jaki sposób dany zestaw został skalibrowany. Testy ELISA alergeny są użyteczne w ocenie poziomu zanieczyszczenia produktu, analizie trendów, porównywaniu wariantów czyszczenia, wyznaczaniu stopnia redukcji pozostałości, badaniu wpływu reworku oraz potwierdzaniu wyników testów przesiewowych. Metoda ta dobrze nadaje się także do analizy większej liczby próbek jednocześnie. W literaturze ELISA jest opisywana jako jedna z najczęściej wykorzystywanych metod do wykrywania i oznaczania ilościowego białek alergenowych w przemyśle spożywczym. W zależności od zestawu analiza trwa od kilkudziesięciu minut do kilku godzin i wymaga ekstrakcji próbki oraz podstawowego wyposażenia laboratoryjnego [3].

Mikroprzepływowa ELISA

Rozwój technologii mikroprzepływowych pozwala skracać czas oznaczenia. W badaniu dotyczącym czujnika opartego na mikroprzepływowej ELISA wykazano możliwość ilościowego oznaczania glutenu i białka Ara h 1 w czasie około 15–20 minut [5]. Nie zmienia to jednak podstawowej zasady, zgodnie z którą wiarygodność wyniku zależy od jakości ekstrakcji, odzysku, zakresu kalibracyjnego i zgodności metody z badaną matrycą.

Testy LFT w monitoringu procesowym

LFT, określany również jako LFA lub LFIA, jest testem immunochromatograficznym przepływu bocznego. Po naniesieniu ekstraktu próbki ciecz przemieszcza się wzdłuż membrany pod wpływem sił kapilarnych. Obecne w próbce białko alergenne wiąże się ze znakowanym przeciwciałem, a powstały kompleks zostaje wychwycony na linii testowej. Pojawienie się barwnej linii świadczy o wykryciu analitu powyżej określonego progu. Linia kontrolna potwierdza prawidłowy przebieg testu. W walidowanym teście do orzeszków ziemnych zastosowano przeciwciała sprzężone ze złotem koloidalnym, a nagromadzenie kompleksów na linii testowej prowadziło do powstania widocznego czerwonego sygnału [4].

Testy LFT alergeny są szczególnie przydatne w sytuacjach, w których konieczne jest szybkie podjęcie decyzji na linii produkcyjnej. Mogą służyć do oceny wymazów po czyszczeniu, badania ostatniej wody popłucznej, kontroli trudnych punktów instalacji i podejmowania decyzji o rozpoczęciu kolejnej produkcji. Wynik uzyskuje się zazwyczaj w ciągu kilku lub kilkunastu minut. Badania porównujące różne formaty przepływowe wykazały możliwość oznaczania alergenów orzechów ziemnych i laskowych w czasie od jednej do dziesięciu minut, przy czym parametry testu zależały od konfiguracji membrany, kinetyki wiązania i rodzaju matrycy [6].

ELISA i LFT – zastosowanie i ograniczenia

ELISA i LFT nie powinny być przedstawiane jako metody konkurencyjne, lecz jako narzędzia odpowiadające na różne potrzeby. ELISA jest bardziej odpowiednia, gdy konieczne jest uzyskanie wartości liczbowej, porównanie wyników w czasie, analiza większej serii próbek lub potwierdzenie wyniku przesiewowego. LFT sprawdza się w szybkim monitoringu procesowym, zwłaszcza przy badaniu pojedynczych wymazów i popłuczyn. ELISA wymaga większego zaplecza technicznego, starannego pipetowania, kontroli krzywej kalibracyjnej i interpretacji jednostek. LFT jest prostszy i łatwiejszy do zastosowania w warunkach produkcyjnych, ale najczęściej dostarcza wyniku jakościowego lub progowego. Czytniki pasków mogą ograniczyć subiektywność odczytu, jednak nie zawsze przekształcają test w pełnoprawną metodę ilościową. Efekt matrycy może być związany z obecnością tłuszczów, polifenoli, soli, detergentów, środków dezynfekcyjnych, skrajnego pH lub dużej lepkości. Czynniki te mogą pogarszać ekstrakcję, hamować wiązanie przeciwciał albo zaburzać przepływ przez membranę. W przypadku ELISA szczególną trudność mogą stanowić oleje jadalne, ponieważ metoda opiera się na układzie wodnym, a białka mogą być obecne w bardzo małych ilościach lub słabo przechodzić do ekstraktu [3].

Reaktywność krzyżowa

Kolejnym ograniczeniem jest reaktywność krzyżowa. Przeciwciało może rozpoznawać białko o podobnej strukturze pochodzące z innego surowca, co prowadzi do wyniku fałszywie dodatniego. Zjawisko to jest szczególnie istotne w przypadku blisko spokrewnionych gatunków lub białek o konserwatywnej budowie. Przed wdrożeniem testu należy zapoznać się z danymi dotyczącymi swoistości i interferencji. W walidacji testu LFT do orzeszków ziemnych nie stwierdzono reaktywności krzyżowej z dwudziestoma dziewięcioma powszechnymi produktami spożywczymi, jednak wykazano możliwość zakłócenia wyniku przez orzech włoski [4].

Efekt hook

Szczególnie ważnym ograniczeniem testów kanapkowych jest efekt hook. Przy bardzo wysokim stężeniu alergenu może dojść do nasycenia przeciwciał i zahamowania tworzenia kompleksu odpowiedzialnego za sygnał. Paradoksalnie próbka o bardzo wysokiej zawartości alergenu może wówczas dać słabą linię testową lub wynik pozornie ujemny. Badania LFT do orzeszków ziemnych i laskowych wykazały, że wysokie stężenia analitu mogą wpływać zarówno na linię testową, jak i kontrolną, a końcowy stosunek sygnałów staje się niewiarygodny poza zakresem roboczym testu [7]. W praktyce próbki, w których można oczekiwać wysokiego poziomu alergenu, powinny być badane zgodnie z instrukcją dotyczącą rozcieńczeń. Podejrzanie słaby sygnał nie powinien być automatycznie interpretowany jako niska zawartość analitu.

Walidacja czyszczenia i dokumentacja monitoringu

Walidacja czyszczenia alergenów ma wykazać, że zaprojektowana procedura jest zdolna do powtarzalnego usunięcia określonego alergenu do przyjętego poziomu. Przeprowadza się ją przed wdrożeniem procedury, po jej istotnej zmianie lub po zmianie procesu, produktu albo urządzenia. Powinna obejmować warunki reprezentujące najtrudniejszy przypadek, między innymi produkt o najwyższej zawartości alergenu, długą kampanię produkcyjną, powierzchnie najtrudniejsze do czyszczenia i minimalne dopuszczalne parametry mycia. W ramach walidacji należy przeprowadzić kilka niezależnych cykli i zgromadzić dowody pochodzące z różnych rodzajów próbek. Mogą to być wyniki z wymazów, popłuczyn, produktu oraz ilościowych oznaczeń ELISA. Jeden ujemny wynik nie jest wystarczającym dowodem skuteczności całej procedury. Rutynowa weryfikacja odpowiada natomiast na pytanie, czy zatwierdzona procedura została prawidłowo wykonana w konkretnym cyklu. Obejmuje sprawdzenie czasu, temperatury, stężenia środków myjących, przepływu, demontażu elementów, ocenę wzrokową oraz szybkie testy LFT z powierzchni lub popłuczyn. Okresowo weryfikację można rozszerzać o badania ELISA. Walidacja wykazuje zdolność procesu, natomiast weryfikacja potwierdza jego bieżące wykonanie [5].

Rejestrowanie wyników i działania korygujące

Dokumentacja monitoringu powinna umożliwiać pełne odtworzenie badania. Należy rejestrować identyfikację produktu i partii, miejsce oraz czas pobrania, rodzaj próbki, powierzchnię wymazu lub objętość popłuczyn, nazwę alergenu, producenta i numer partii zestawu, termin ważności, sposób ekstrakcji, rozcieńczenie, czas odczytu, wynik, jednostkę, kryterium akceptacji oraz decyzję podjętą na jego podstawie. W przypadku ELISA należy zachowywać krzywe kalibracyjne, wyniki kontroli dodatnich i ujemnych, powtórzenia oraz informacje o przekroczeniu zakresu oznaczalności. W przypadku LFT pomocne jest archiwizowanie zdjęcia paska wykonanego w zalecanym czasie odczytu. Wynik dodatni powinien prowadzić do wstrzymania zwolnienia linii lub partii, sprawdzenia poprawności procedury badawczej i pobrania nowej próbki. W zależności od znaczenia decyzji wynik LFT może wymagać potwierdzenia metodą ELISA. Następnie należy określić zasięg potencjalnie zagrożonego produktu, ponownie przeprowadzić czyszczenie, zidentyfikować źródło pozostałości i wykonać analizę przyczyny źródłowej. Działania korygujące mogą obejmować zmianę instrukcji, zwiększenie częstotliwości badań, modyfikację harmonogramu produkcji, zmianę sposobu demontażu urządzenia lub dodatkowe szkolenie personelu [8].

Dobór testu do alergenu, matrycy i celu analizy

Dobór testu powinien zawsze odnosić się do konkretnego alergenu, matrycy i poziomu decyzyjnego. Należy ustalić, czy test wykrywa cały surowiec, białko całkowite, białko rozpuszczalne czy pojedynczy marker, na przykład kazeinę, β-laktoglobulinę, gliadynę albo Ara h 1. Dwa zestawy opisane jako testy na mleko mogą reagować z innymi frakcjami białkowymi i zachowywać się odmiennie po ogrzewaniu. Równie ważny jest rodzaj próbki. Metoda zwalidowana dla produktu nie musi być odpowiednia dla wymazu, a test przeznaczony do wody może nie działać prawidłowo w roztworze alkalicznym lub dezynfekcyjnym. Należy również sprawdzić, czy walidacja obejmowała produkt pieczony, prażony, fermentowany, tłusty lub kwaśny. O zastosowaniu metody powinien decydować nie tylko jej deklarowany limit wykrywalności, ale także odzysk, precyzja, swoistość, zakres roboczy i odporność na niewielkie odchylenia proceduralne. Poziom decyzyjny musi być zdefiniowany przed rozpoczęciem badań. Może nim być próg testu jakościowego, wewnętrzny limit działania, granica oznaczalności, kryterium walidacji czyszczenia lub wartość wynikająca z oceny ryzyka. Granica wykrywalności informuje, że analit może zostać zauważony, natomiast nie zawsze oznacza, że jego stężenie może być wiarygodnie określone. Do podejmowania decyzji ilościowych większe znaczenie mają granica oznaczalności, odzysk i niepewność wyniku. Walidacja producenta zestawu nie zastępuje sprawdzenia metody w warunkach konkretnego zakładu. Przed rozpoczęciem rutynowego stosowania należy przeprowadzić weryfikację wdrożeniową z użyciem rzeczywistych matryc, próbek ujemnych, materiału zawierającego alergen oraz próbek na poziomie zbliżonym do przyjętego progu działania. Należy również sprawdzić powtarzalność wyników pomiędzy operatorami. Literatura wskazuje, że komercyjne zestawy różnią się czułością, swoistością, standardami kalibracyjnymi, czasem analizy i kosztami, a metoda właściwa dla jednego produktu może być nieodpowiednia dla innego [3].

Praktyczny wybór metody powinien wynikać z celu analizy. Gdy decyzja musi zostać podjęta natychmiast przy linii, właściwym rozwiązaniem jest zazwyczaj LFT zwalidowany dla danego alergenu i rodzaju próbki. Gdy potrzebny jest wynik liczbowy, ocena trendu, porównanie wariantów czyszczenia lub potwierdzenie wyniku przesiewowego, bardziej odpowiednia jest ilościowa ELISA. Jeżeli próbka była intensywnie przetwarzana, zawiera dużo tłuszczu, polifenoli, soli albo środków chemicznych, konieczna jest szczegółowa ocena wpływu matrycy. W przypadku możliwego wysokiego stężenia należy uwzględnić efekt hook i zastosować kontrolowane rozcieńczenie. Jeżeli wynik ma zdecydować o zwolnieniu dużej partii, powinien być potwierdzony badaniem powtórnym, a w razie potrzeby także drugą metodą [9].

Powiązane produkty Argenta

Test ELISA

SENSISpec ELISA Peanut

Nr katalogowy: HU0030019

Zestaw do oznaczania alergenu orzeszków ziemnych metodą ELISA. Wariant katalogowy obejmuje 96 oznaczeń.

Zobacz testy w Bestlabs Pobierz materiał

Test LFT

SENSIStrip Peanut

Nr katalogowy: HU0030128

Szybki test przepływu bocznego do detekcji alergenu orzeszków ziemnych. Wariant katalogowy obejmuje 20 testów.

Zobacz test w Bestlabs Pobierz materiał

Analizator ELISA

BOLT

Nr katalogowy: 00500

Jednopłytkowy analizator automatyzujący metodę ELISA, przeznaczony do pracy z maksymalnie 96 probówkami pierwotnymi.

Zobacz analizator

Podsumowanie

Skuteczny monitoring alergenów nie opiera się na jednym teście. Jest wynikiem połączenia analizy ryzyka, kwalifikacji dostawców, segregacji surowców, kontroli reworku, organizacji produkcji, prawidłowego etykietowania, walidacji czyszczenia, rutynowej weryfikacji oraz właściwie zaprojektowanego planu badań. Testy ELISA alergeny dostarczają przede wszystkim informacji ilościowej i są szczególnie użyteczne w badaniach potwierdzających. Testy LFT alergeny umożliwiają szybką ocenę sytuacji bezpośrednio na linii. Żadna z metod nie jest zawsze lepsza. Ich wartość zależy od zgodności z konkretnym alergenem, matrycą, procesem technologicznym i poziomem decyzyjnym.

FAQ

Bibliografia