Rola wzbogacania w wykrywaniu Listeria

W badaniach mikrobiologicznych żywności i środowiska wykrycie drobnoustroju nie zawsze zaczyna się od bezpośredniego wysiewu próbki na agar.

Gdy poszukiwany mikroorganizm może występować w niewielkiej liczbie i jednocześnie towarzyszy mu liczna mikroflora, istotnym elementem procedury staje się wzbogacanie Listeria.

Właśnie na tym etapie zastosowanie znajdują podłoża z rodziny Fraser, w tym pożywka Half Fraser.

W portfolio Thermo Fisher Scientific dostępne są różne warianty podłoża Half Fraser, dopasowane do potrzeb i preferencji użytkownika – od podłoży odwodnionych, wymagających przygotowania z użyciem odpowiedniego suplementu, przez gotowe do użycia podłoże Half Fraser Broth, aż po wygodne formaty workowe Dry-Bags™. Różnią się przede wszystkim sposobem przygotowania i skalą, w jakiej mogą być wykorzystywane w laboratorium. [1]

Jak działa podłoże Half Fraser?

Fraser Broth Base (ISO), oznaczony kodem CM0895, jest bazą, z której – zależnie od zastosowanego suplementu – można przygotować zarówno Half Fraser Broth, jak i Fraser Broth.

Producent podaje, że baza zawiera m.in. peptony, ekstrakt mięsny i drożdżowy, chlorek sodu, fosforany, eskulinę oraz chlorek litu. [2]

W przypadku przygotowania Half Fraser do bazy dodawany jest Half Fraser Selective Supplement.

Suplement jest przeznaczony do selektywnej izolacji Listeria spp. Zawiera on cytrynian amonowo-żelazowy, kwas nalidyksowy oraz akryflawinę. Dostępne są warianty przeznaczone do przygotowania 225 ml podłoża (SR0166E) i 2,25 l podłoża (SR0166G). [3]

Tak przygotowane podłoże do Listeria ma dwa ważne zadania.

Z jednej strony powinno umożliwiać namnażanie poszukiwanych bakterii, w tym Listeria monocytogenes, a z drugiej ograniczać wpływ części mikroflory towarzyszącej.

Znaczenie tej selektywności dobrze pokazują badania kontroli jakości.

W testach kontroli jakości zgodnie z ISO 11133:2014 uzyskiwano wzrost charakterystycznych kolonii L. monocytogenes, podczas gdy organizmy towarzyszące, Escherichia coli oraz Enterococcus faecalis, nie wykazywały wzrostu na tym podłożu. [4]

To właśnie istota działania, jakiego oczekuje się od podłoża selektywnego stosowanego na etapie wzbogacania: stworzenie warunków sprzyjających odzyskaniu organizmu docelowego przy jednoczesnym ograniczeniu konkurencji ze strony części mikroflory próbki.

Etap wzbogacania w procedurze badania

W uproszczeniu schemat badania ukierunkowanego na wykrywanie Listeria można przedstawić następująco:

W materiałach dotyczących suplementu Half Fraser producent po inkubacji podłoża wykonuje pasaż na Brilliance™ Listeria Agar (ISO).

W specyfikacji gotowego Oxoid Half Fraser Broth BO0350S po inkubacji również przewidziany jest wysiew na Chromogenic Listeria Agar (ISO). [4] [5]

Pokazuje to, że etap wzbogacania nie jest sam w sobie końcową identyfikacją mikroorganizmu.

Jego zadaniem jest przygotowanie materiału do kolejnych etapów izolacji i oceny.

Dlaczego ma to szczególne znaczenie w przypadku podłoży do mikrobiologii żywności?

Próbka żywności lub materiał środowiskowy może zawierać bardzo zróżnicowaną mikroflorę.

Bez odpowiedniego wzbogacania organizmy konkurencyjne mogą utrudniać odzyskanie i późniejsze wyizolowanie poszukiwanego mikroorganizmu.

Podłoża selektywne pomagają więc zwiększyć szansę na wychwycenie organizmu docelowego w złożonej próbce, zanim materiał zostanie przeniesiony na podłoże stałe.

Czernienie podłoża i interpretacja wyniku presumptywnego

Jedną z charakterystycznych cech podłoży Fraser jest możliwość obserwacji reakcji związanej z hydrolizą eskuliny.

Specyfikacje suplementów Half Fraser wskazują, że dodatnie szczepy Listeria monocytogenes powinny wykazywać hydrolizę eskuliny po inkubacji.

W dokumentacji kontrolnej producent używa również określenia „no blackening” w odniesieniu do braku tej reakcji u szczepu kontrolnego Bacillus cereus. [6]

Ocena barwy podłoża nie może zastępować kolejnych etapów procedury.

Materiały producenta dotyczące kontroli produktywności Half Fraser obejmują po inkubacji dalszy wysiew na podłoże agarowe do izolacji bakterii z rodzaju Listeria. [4]

Dlatego dalsze postępowanie z hodowlą, zarówno przy obserwowanym czernieniu, jak i przy jego braku, należy prowadzić zgodnie z aktualną instrukcją producenta oraz właściwą metodą stosowaną w laboratorium.

Warianty Half Fraser i ich przygotowanie

Portfolio pozwala dobrać sposób przygotowania podłoża do organizacji pracy konkretnego laboratorium.

Fraser Broth Base CM0895 i suplement

Fraser Broth Base CM0895 jest odwodnioną bazą do samodzielnego przygotowania podłoża.

Producent podaje dwie procedury przygotowania Half Fraser:

• 12,9 g bazy na 225 ml wody, a następnie dodanie jednej fiolki SR0166E,
• 129,2 g bazy na 2,25 l wody, a następnie dodanie jednej fiolki SR0166G.

W obu przypadkach baza jest sterylizowana w autoklawie przez 15 minut w 121°C, chłodzona do 50°C, a następnie aseptycznie uzupełniana wcześniej odtworzonym suplementem. [2]

Ta forma oznacza, że laboratorium samodzielnie wykonuje kolejne operacje przygotowawcze: odmierzenie bazy i wody, rozpuszczenie, sterylizację, chłodzenie, przygotowanie suplementu, jego aseptyczne dodanie oraz rozlanie podłoża do odpowiednich naczyń.

Suplement Oxoid Half Fraser jest dostępny w dwóch wariantach:

• SR0166E – jedna fiolka przeznaczona jest do suplementacji 225 ml Fraser Broth Base,
• SR0166G – jedna fiolka przeznaczona jest do suplementacji 2,25 l Fraser Broth Base. [3]

Przed dodaniem producent zaleca odtworzenie zawartości fiolki w 4 ml mieszaniny etanolu i sterylnej wody destylowanej w proporcji 1:1, a następnie aseptyczne wprowadzenie suplementu do przygotowanej i schłodzonej do 50°C bazy. [3]

Gotowy Half Fraser Broth BO0350S

Alternatywą jest Half Fraser Broth BO0350S w postaci gotowego podłoża.

Produkt jest dostarczany jako 10 butelek PET o pojemności 250 ml, zawierających po 225 ml podłoża i zamykanych zakrętką.

Producent określa dla tego wariantu warunki przechowywania w zakresie 2–12°C, z ochroną przed światłem. [5]

W tym przypadku laboratorium nie przygotowuje podłoża poprzez odważanie Fraser Broth Base, autoklawowanie i późniejsze dodawanie suplementu, pracuje z już przygotowanym formatem 225 ml.

Jest to różnica organizacyjna i proceduralna.

Właśnie w tej kategorii mieszczą się gotowe podłoża mikrobiologiczne: wybór formatu może ograniczyć liczbę czynności związanych z własnym przygotowaniem podłoża, ale jego faktyczny wpływ na ekonomikę i organizację procesu zależy od warunków danego laboratorium.

Dry-Bags™ Half Fraser Broth

Katalog producenta obejmuje również Dry-Bags™ Half Fraser Broth.

Produkt jest oferowany w opakowaniach po pięć worków, przy czym każdy worek to 20 l podłoża.

W katalogu znajdują się warianty DB0895L oraz DB0895V, z czego drugi opisany jest jako wersja bez filtrów. [7]

Dry-Bags™ znajdują się w katalogu w kategorii odwodnionych podłoży hodowlanych i akcesoriów workowych.

Nie jest to więc odpowiednik gotowej butelki BO0350S, lecz rozwiązanie przewidziane do pracy z większą objętością podłoża.

Szczegółowy sposób przygotowania i zastosowania konkretnego wariantu należy każdorazowo sprawdzić w aktualnej instrukcji producenta.

Dobór formatu do pracy laboratorium

Wybór pomiędzy Fraser Broth Base z suplementem, gotowym Half Fraser Broth i Dry-Bags™ warto oprzeć na rzeczywistym sposobie pracy laboratorium.

Baza odwodniona + suplement może być odpowiednia tam, gdzie przygotowywanie podłoży jest standardowym elementem procesu, dostępny jest autoklaw i infrastruktura do pracy aseptycznej, a laboratorium chce samodzielnie przygotowywać określone partie podłoża.

Gotowy Half Fraser Broth w porcjach po 225 ml może być wygodnym rozwiązaniem dla laboratoriów, które wykorzystują taki format bezpośrednio w swoim schemacie pracy i chcą ograniczyć liczbę etapów związanych z przygotowywaniem podłoża z bazy i suplementu.

Dry-Bags™ Half Fraser Broth, gdzie jeden worek odpowiada 20 l przygotowanego podłoża, jest formatem wartym rozważenia w procesach wykorzystujących większe, powtarzalne objętości. [7]

Przy wyborze formatu dobrze uwzględnić przede wszystkim:

• liczbę i rodzaj wykonywanych badań,
• potrzebną jednorazowo objętość podłoża,
• częstotliwość przygotowywania partii,
• dostępność autoklawu i warunków aseptycznych,
• przestrzeń oraz wymagania dotyczące przechowywania,
• sposób prowadzenia kontroli jakości przygotowanych podłoży,
• wymagania dotyczące identyfikowalności partii,
• zgodność konkretnego produktu z aktualnie stosowaną metodą i instrukcją producenta.

Nie ma jednego formatu optymalnego dla każdego laboratorium.

Kryterium powinien stanowić cały proces analityczny, a nie wyłącznie to, czy podłoże dostarczane jest jako proszek, suplement, gotowa butelka czy system workowy.

Half Fraser a ISO 11290-1

W przypadku odniesień do ISO 11290-1 warto zachować precyzję.

Specyfikacja gotowego Oxoid Half Fraser Broth BO0350S jednoznacznie podaje, że produkt jest „tested in accordance with ISO 11133 and ISO 11290-1”. [5]

Na tej podstawie można więc wskazać, że producent deklaruje testowanie tego konkretnego produktu zgodnie z ISO 11290-1.