Od dodatniego posiewu krwi do wyniku lekowrażliwości - gdzie laboratorium może skrócić czas diagnostyki?

Czas do wyniku w diagnostyce dodatnich posiewów krwi

W diagnostyce sepsy znaczenie ma nie tylko szybkość pojedynczego analizatora, ale przede wszystkim czas całej ścieżki diagnostycznej. Z punktu widzenia laboratorium czas do wyniku zaczyna się znacznie wcześniej niż pomiar w MALDI-TOF czy rozpoczęcie oznaczania lekowrażliwości i kończy później niż pojawienie się rezultatu na ekranie analizatora. Dlatego, analizując TAT w mikrobiologii (turnaround time), należy uwzględnić kolejno, wykrycie dodatniego posiewu krwi, przygotowanie materiału, identyfikację drobnoustroju, wybór i wykonanie oznaczenia lekowrażliwości, weryfikację i autoryzację wyniku oraz jego przekazanie do LIS i zespołu klinicznego.

Cały proces można przedstawić w następującym ciągu:

Wykrywanie dodatnich posiewów krwi – BC120 i BC60

Pierwszym etapem procesu są systemy do posiewów krwi BC120 i BC60. BC120 wykorzystuje optyczny system wykrywania oraz kontrolę temperatury i moduł wibracyjny. Producent podaje minimalny czas wykrycia próbki dodatniej wynoszący 3 godziny. System umożliwia również połączenie z LIS [2]. Odczyt wykonywany jest co 10 minut, a butelki powinny zostać umieszczone w aparacie możliwie szybko po pobraniu [3]. Jest to dobry przykład różnicy między parametrem technicznym urządzenia a pełnym TAT. BC60 pełni analogiczną rolę na etapie inkubacji i wykrywania dodatnich posiewów, a jego modułowa konstrukcja umożliwia obsługę do 360 pozycji. Oprogramowanie pozwala m.in. analizować współczynnik zgłaszania butelek dodatnich oraz czas ich usuwania po uzyskaniu wyniku dodatniego [4].

Przygotowanie materiału i barwienie metodą Grama

Od momentu zarejestrowania przez system dodatniego sygnału zaczyna się kolejny krytyczny etap TAT. Dodatni posiew krwi powinien zostać objęty ustaloną ścieżką priorytetową, tak aby butelka została możliwie szybko wyjęta z aparatu i przekazana do dalszej diagnostyki. Po wyjęciu dodatniej butelki przygotowuje się materiał do dalszych badań. Na tym etapie materiał pochodzi bezpośrednio z dodatniej butelki posiewowej. Wykonuje się preparat mikroskopowy i ocenę wstępną, w tym barwienie metodą Grama. Standaryzację tego etapu może wspierać RAL Stainer – zautomatyzowana jednostka do barwienia metodą zanurzeniową. Zestaw RAL Stainer Gram-Nicolle służy do różnicowania mikroorganizmów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, a gotowe odczynniki oraz krótki protokół sprzyjają standaryzacji procedury [5].

Wynik oceny mikroskopowej stanowi pierwszą informację pozwalającą ukierunkować dalsze postępowanie. Ważne jest jednak nie tylko samo wykonanie preparatu, lecz również to, jak szybko po uzyskaniu informacji wstępnej uruchamiane są kolejne badania. Jeżeli dodatnia butelka czeka na zakończenie bieżącej serii badań, rozpoczęcie kolejnej zmiany lub dostępność konkretnego pracownika, opóźnienie powstałe na tym etapie zostanie przeniesione na wszystkie kolejne części procesu. Po ocenie wstępnej kolejnym etapem jest identyfikacja mikroorganizmu. W tym miejscu należy wyraźnie rozróżnić dwa możliwe sposoby postępowania, identyfikację wykonywaną z materiału pochodzącego z dodatniego posiewu krwi oraz identyfikację wykonywaną z wyizolowanej kolonii uzyskanej po hodowli.

Identyfikacja drobnoustrojów metodą MALDI-TOF

W przypadku procedury umożliwiającej identyfikację z dodatniego posiewu materiał pobiera się z dodatniej butelki posiewowej, a następnie odpowiednio przygotowuje zgodnie ze zwalidowanym protokołem laboratorium. Autof MS2600 jest automatycznym systemem identyfikacji wykorzystującym technologię MALDI-TOF. Materiały produktowe wskazują wydajność do 960 próbek na godzinę oraz możliwość identyfikacji mikroorganizmów z dodatnich posiewów krwi [7]. Taka ścieżka może ograniczyć czas oczekiwania na identyfikację, ponieważ nie wymaga wcześniejszego uzyskania wyizolowanej kolonii, pod warunkiem zastosowania właściwej i zwalidowanej procedury przygotowania materiału. Drugim wariantem jest klasyczna identyfikacja MALDI-TOF wykonywana z wyizolowanej kolonii. W tym przypadku materiał z dodatniej butelki jest wcześniej wysiewany na odpowiednie podłoża, a identyfikację wykonuje się dopiero po uzyskaniu wzrostu kolonii. W materiałach dotyczących Autof MS1000 wskazany jest taki właśnie przebieg zaczynając od pobrania wyizolowanej kolonii, przygotowanie płytki, dodanie matrycy, pomiar, automatyczne dopasowanie widma do bazy referencyjnej oraz końcową weryfikację wyniku przez diagnostę laboratoryjnego lub mikrobiologa. Sam system może uzyskać identyfikację mikroorganizmu w czasie 0,1 sekundy [6]. Wartość ta dotyczy jednak samego etapu analitycznego wykonywanego przez analizator, a nie pełnego czasu od wykrycia dodatniego posiewu krwi do wydania autoryzowanego wyniku. W ścieżce opartej na kolonii do TAT należy doliczyć m.in. czas potrzebny na wysiew materiału, inkubację i uzyskanie odpowiedniego wzrostu, przygotowanie płytki MALDI-TOF, ewentualne oczekiwanie na załadunek, a następnie weryfikację wyniku. Dopiero po uzyskaniu identyfikacji drobnoustroju, laboratorium może zdecydować, jaką metodą wykonać oznaczenie lekowrażliwości.

Szybkie oznaczanie lekowrażliwości – dRAST

Kolejnym punktem decyzyjnym jest wybór pomiędzy metodami szybkiego AST a rutynowym oznaczeniem lekowrażliwości. System dRAST został zaprojektowany do wykonywania szybkiego fenotypowego oznaczenia lekowrażliwości bezpośrednio z dodatniego posiewu krwi. Oznacza to, że na tym etapie materiałem wejściowym jest materiał z dodatniej butelki posiewowej, a nie wyizolowana kolonia. System umożliwia oznaczanie MIC metodą mikrorozcieńczeń w bulionie. Pełny wynik można uzyskać najwcześniej po około 4 godzinach, przy czym w zależności od badanego drobnoustroju i zastosowanego panelu czas uzyskania wyniku może wynosić do 8 godzin.

W materiałach producenta opisano panele przeznaczone dla najczęściej izolowanych z krwi mikroorganizmów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, system ekspercki umożliwiający interpretację według EUCAST i CLSI oraz dwukierunkową komunikację z LIS [8]. Dzięki wykonaniu oznaczenia bezpośrednio z dodatniego posiewu krwi metoda ta pozwala ograniczyć część czasu związanego z konwencjonalną, wieloetapową ścieżką diagnostyczną. dRAST jest więc przykładem metody szybkiego AST, której korzyść czasowa zależy jednak również od tego, jak szybko próbka zostanie skierowana do badania po uzyskaniu odpowiednich informacji diagnostycznych.

Rutynowe oznaczanie lekowrażliwości – Sensititre ARIS HiQ

W przypadkach kierowanych do rutynowego oznaczania lekowrażliwości można wykorzystać Sensititre ARIS HiQ. W tej ścieżce badanie wykonuje się po przygotowaniu odpowiedniego inokulum z wyizolowanego drobnoustroju, a więc po uzyskaniu wzrostu hodowlanego. System oferuje standardowe oraz konfigurowalne opcje AST, oprogramowanie SWIN z systemem eksperckim zintegrowanym z rekomendacjami EUCAST, łączność z LIS oraz automatyczny odczyt płytek. Automatyczny odczyt po 18 i 24 godzinach bez konieczności nadzoru pracownika [9]. Wybór między metodą szybkiego AST a rutynowym oznaczaniem powinien zatem wynikać z ustalonego algorytmu obejmującego m.in. wynik identyfikacji drobnoustroju, ocenę wstępną, rodzaj dostępnych paneli oraz zwalidowane procedury laboratorium.

Weryfikacja, autoryzacja i przekazanie wyniku

Uzyskanie wyniku przez analizator nie kończy TAT. Kolejnymi etapami są jego przegląd, interpretacja, weryfikacja i autoryzacja, a następnie przekazanie informacji do LIS oraz bezpośrednio do zespołu klinicznego. Raport widoczny na ekranie analizatora nie jest jeszcze wynikiem wykorzystanym klinicznie. WHO wskazuje na potrzebę natychmiastowego przekazywania zespołom klinicznym wyników krytycznych, w tym wstępnych wyników dodatnich posiewów krwi oraz informacji o wykryciu drobnoustrojów wielolekoopornych [11].

Analiza TAT w całym procesie diagnostycznym

Z perspektywy TAT warto więc mierzyć nie tylko moment result available, czyli pojawienia się wyniku w systemie analitycznym, lecz również result verified, result authorized oraz result communicated. Analiza TAT powinna obejmować cały proces, ponieważ istotna część możliwych do ograniczenia opóźnień powstaje między kolejnymi czynnościami diagnostycznymi, a nie podczas samego pomiaru. Dotyczy to m.in. oczekiwania na odbiór dodatniej butelki z aparatu, transportu materiału, wykonania preparatu, rozpoczęcia identyfikacji, uruchomienia oznaczenia lekowrażliwości, weryfikacji i autoryzacji wyniku oraz przekazania informacji lekarzowi. W tym kontekście przydatny jest podział procesu laboratoryjnego na fazę przedanalityczną, analityczną i poanalityczną. Do fazy przedanalitycznej należą m.in. pobranie materiału, jego transport, rejestracja oraz umieszczenie butelki w systemie do posiewów krwi. Faza analityczna obejmuje wykrycie wzrostu, przygotowanie materiału, identyfikację oraz oznaczenie lekowrażliwości. Faza poanalityczna obejmuje natomiast weryfikację, interpretację, autoryzację, raportowanie i komunikację wyniku [1]. WHO wskazuje m.in. na znaczenie opóźnień w transporcie materiału oraz podkreśla, że możliwości laboratorium zależą od zasobów, w tym dostępności personelu i infrastruktury [1,10]. W praktyce oznacza to, że rzeczywisty czas diagnostyki zależy nie tylko od parametrów urządzeń, ale również od organizacji transportu, liczby osób dostępnych na poszczególnych zmianach, harmonogramu pracy, dostępu do aparatury oraz zasad priorytetyzacji dodatnich posiewów krwi.

Dlatego automatyzację mikrobiologii należy oceniać jako element całego procesu. BC120 lub BC60 mogą szybko wykryć wzrost, MALDI-TOF może bardzo szybko przeprowadzić sam pomiar identyfikacyjny, a dRAST może dostarczyć pełny wynik lekowrażliwości najwcześniej po około 4 godzinach do około 8 godzin. Jeżeli jednak dodatnia butelka przez dwie godziny czeka na wyjęcie z aparatu, materiał czeka na wykonanie preparatu, identyfikacja na dostępność operatora, AST na uruchomienie odpowiedniego stanowiska, a gotowy wynik na autoryzację, część przewagi wynikającej z zastosowania szybkich technologii zostaje utracona.

Kolejne kroki audytu TAT bez zmiany metody

Gdzie można skrócić czas diagnostyki?

Tak przeprowadzony audyt często ujawnia możliwość skrócenia czasu do wyniku bez zmiany metody analitycznej. Najważniejsze jest prześledzenie kolejności postępowania z dodatnim posiewem krwi, od zarejestrowania dodatniego sygnału w BC120/BC60, przez szybkie wyjęcie i przygotowanie butelki, wykonanie preparatu, wybór właściwej ścieżki identyfikacji, a następnie dobór i uruchomienie odpowiedniej metody oznaczania lekowrażliwości. Na każdym z tych etapów materiał i cel badania są inne. Na początku laboratorium pracuje bezpośrednio z dodatnią butelką posiewową. Identyfikację można przeprowadzić z odpowiednio przygotowanego materiału pochodzącego z dodatniej butelki albo z wyizolowanej kolonii uzyskanej po hodowli. Podobnie w AST, dRAST pozwala rozpocząć badanie bezpośrednio z dodatniego posiewu krwi, natomiast rutynowe oznaczenie w Sensititre ARIS HiQ wymaga przygotowania materiału z wyizolowanego drobnoustroju. Możliwości skrócenia TAT znajdują się więc zarówno w samej metodzie analitycznej, jak i pomiędzy kolejnymi etapami, podczas transportu i załadunku butelki, odbioru dodatniego posiewu, przygotowania preparatu, rozpoczęcia identyfikacji, wyboru i uruchomienia AST, a następnie weryfikacji, autoryzacji i komunikacji wyniku. W diagnostyce zakażeń krwi czas jest właściwością całej uporządkowanej ścieżki postępowania z dodatnim posiewem, a nie pojedynczego urządzenia. Dopiero połączenie szybkich metod z właściwą organizacją pracy pozwala przełożyć ich parametry techniczne na rzeczywiste skrócenie TAT w mikrobiologii [12].